胃癌患者外周血Cyttel循環(huán)腫瘤細胞的檢測及臨床意義

李娟娟 張超

胃癌是一種具有較高發(fā)病率的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，因發(fā)現(xiàn)時一般失去手術機會，其死亡率較其他惡性腫瘤明顯升高[1]。有資料顯示，早期胃癌患者的5 年生存率可達90%以上，但胃癌總體生存率只有30%左右，其中導致中晚期胃癌患者生存率下降的主要原因系惡性腫瘤細胞的轉移或復發(fā)[2]。因此，臨床需及早發(fā)現(xiàn)和明確患者病情，并對其進行進行有效地治療，從而延長患者生存時間，改善患者預后。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）一般通過兩種途徑進入外周血循環(huán)：一是直接脫落于惡性腫瘤的原發(fā)病灶，二是脫落于惡性腫瘤的轉移病灶，脫落的腫瘤細胞可隨血液循環(huán)流動，從而導致腫瘤的種植及轉移[3]。據(jù)有關資料顯示，通過對乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者，實施外周血CTCs 檢測，結果顯示均檢出了CTCs，提示CTCs 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用，臨床通過測定患者的CTCs 水平，能夠為臨床疾病篩查、方案制定以及預后預測提供重要幫助[4]。另外，外周血CTCs檢測能夠較常規(guī)檢查更早地發(fā)現(xiàn)微小腫瘤細胞轉移，有助于及早發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)展狀況，為患者預測預后、選擇化療和靶向治療提供重要參考，從而改善患者預后[5]。為了解萊爾(Cyttel)檢測法對外周血CTCs 的檢測情況及意義，本文選取了50 例蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院收治的50 例胃癌患者和40 例胃部良性疾病患者，對其外周血CTCs 檢測結果與病理特性研究如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入胃癌患者50 例，均于2019 年1 月—2021 年1 月在蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院接受治療。其中男性27 例，女性23例，年齡28～81 歲，平均（57.46±3.98）歲。腫瘤分期為Ⅰ期15 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期13 例。腫瘤直徑2～9 cm，平均（4.56±0.83）cm。分化程度：低分化28 例，中-高分化22 例。另選取同期本院胃部良性疾病患者40 例為對照組，其中男24例，女16 例，年齡27～80 歲，平均（58.01±3.96）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），有可比性。

納入標準：（1）均經(jīng)病理等檢查確診。（2）患者臨床資料完整。（3）既往無其他惡性腫瘤。（4）自愿參與本研究。排除標準：（1）嚴重心腦血管疾病。（2）實驗室檢查合并肝腎功能異常。（3）存在嚴重器質性病變。（4）接受抗腫瘤治療者。（5）中途退出研究或不配合研究者。患者及家屬知曉研究并簽署同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

Cyttel 檢測方法：在進行治療前，均對穿刺部位進行嚴格消毒，將采集的4 mL 外周靜脈血置于抗凝管中，室溫保存，所有標本均必須在24 h 內完成檢測。使用Pico15 型高速離心機（美國賽默飛世爾科技公司）。將采集的血樣放置在離心管中，加入45 mL 的磷酸鹽緩沖液，以2 000 r/min 的速度對其進行離心處理，離心5 min 后，除去上清液。然后將300 μL 的磷酸鹽緩沖液加入試管中，對細胞沉淀進行重懸處理。完成上述操作后，選擇適量的磁珠，加入一定的細胞沉淀后，通過水平傾斜搖晃使其能夠充分結合。抽取3 mL 的分離介質，將其加入到離心管中，待其與上述懸液完全疊加后，對其實施離心處理。吸取稀有細胞層至離心管，以2 000 r/min 的速度對其進行5 min 的離心處理，然后棄去上清液，加入1 mL 的磷酸鹽緩沖液，將其轉移至2 mL 的離心管中，并靜置2 min。之后將其轉移至1.5 mL 的離心管中，離心處理（2 000 r/min，離心5 min）。離心后棄去上清至100 μL，另添加100 μL 固定液，混勻，最后常規(guī)涂片、干燥，24 h 內對其進行免疫熒光原位雜交（immuno fluorescence in situ hybridization，imFISH）鑒定。

imFISH 鑒定：將制作好的載玻片常規(guī)進行固定、脫水等處理，加入10μL 的17 號染色體雙探針（chromo-some 17 enumeration probe，CEP-17），封片后進行雜交，時間為1.5 h。操作完成后使用甲酰胺工作液除蓋玻片，并進行探針洗脫與洗滌等處理，在樣本區(qū)加入提前配置的白細胞共同抗原（leukocyte common antigen，CD45）熒光抗體（江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司），于33℃條件下孵育1 h。吸除熒光抗體后，在標本區(qū)滴加10 μL 的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國Sigma Aldrich 公司），并予以封片等處理，熒光顯微鏡下觀察具體情況。

CTCs 判讀標準：熒光顯微鏡下觀察，符合以下標準即可診斷為CTCs 陽性[6]：（1）細胞膜CD 45 染色結果為陰性。（2）DAPI 染色處理后顯示核染色效果較佳，核不論是大還是小，均為較確定的核。（3）細胞核CEP-17 信號超過2 個（兩信號點間距＜單個信號點直徑視為1 個信號點）。（4）細胞表面無磁珠結合，或只有1 個磁珠結合。（5）不存在胞核聚集、疊加或雜志感染情況。

1.3 觀察指標

統(tǒng)計研究組與對照組的CTCs 陽性與陰性例數(shù)，比較其陽性率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%，并比較研究組中陽性與陰性患者的年齡、性別、分化程度、脈管侵犯、腫瘤分期、淋巴結轉移、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9）及糖類抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA 72-4）等資料。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗或Fisher 確切概率法，計量資料以（）表示，行t檢驗，P＜0.05 則差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血CTCs 陽性率比較

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，研究組50 例胃癌患者中檢出CTCs 陽性36 例，其CTCs 陽性率為72.00%（36/50）。對照組40 例患者中只有4例檢出CTCs，對照組CTCs 陽性率為10.00%（4/40），兩組間陽性率比較，χ2=34.596，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 胃癌患者外周血CTCs 陽性與臨床病理特征的關系

胃癌患者中外周血CTCs 陽性患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤分期及淋巴結轉移與陰性患者相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。CTCs 陽性與CTCs 陰性患者的CEA、脈管侵犯、CA 19-9 及CA 72-4 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 研究組胃癌患者外周血CTCs 陽性與臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討論

胃癌是一種起源于胃黏膜細胞的惡性腫瘤，在中老年群體中發(fā)病率較高。近年來，隨著經(jīng)濟發(fā)展和人們生活方式轉變，胃癌發(fā)病率以及病死率均具有顯著上升趨勢。早期發(fā)現(xiàn)和診斷胃癌，有助于及早控制患者病情，降低患者病死率，對患者預后改善具有顯著意義。目前臨床可用于該疾病診斷的方法較多，如血清腫瘤標志物、影像學、胃鏡以及脫落細胞學檢查都是臨床用于胃癌診斷的常用方法，但是存在早期診斷率低的情況，導致大部分患者在確診時已經(jīng)進展至中晚期，存在腫瘤轉移的情況，導致治療效果、預后欠佳[7]。加之患者自身對疾病不夠重視，且胃鏡檢查存在費用高、耗時長和不適強等不足，導致部分患者不愿意配合胃鏡檢查，耽誤治療，導致疾病進展。因此，選擇更為合適的方法及早診斷該疾病具有必要性。腫瘤細胞在進入血液時很快就會死亡，只有少部分活力及轉移能力較強的腫瘤細胞才 能夠得以存活，且在一定條件下聚集，進一步形成轉移灶，這也是腫瘤發(fā)生遠處轉移的最主要形式。有研究提出，來源于上皮組織的癌細胞，在上皮間質轉化后，具備遷移和侵襲血管的能力，通過對外周血CTCs 進行檢測，能夠及早發(fā)現(xiàn)患者的病灶轉移情況，較影像學更早地發(fā)病異常，從而及時予以有效控制，為患者治療爭取更多時間[8]。大部分情況下，由于受到機體微環(huán)境的影響，CTCs 進入到外周血會出現(xiàn)凋亡的情況，只有少部分在抵達適合身材的部位后，才會發(fā)生轉化，并重新獲得相應特性，形成新的轉移病灶。在各種因素的共同影響下，CTCs 可出現(xiàn)免疫逃避的情況，導致免疫殺傷細胞無法對其進行監(jiān)控與識別，導致其不斷向遠處轉移。

CTCs 作為一種具有腫瘤細胞，攜帶了腫瘤的所有分子生物學信息，對其實施動態(tài)監(jiān)測，可動態(tài)反映各階段的腫瘤變化情況。有資料顯示，CTCs 陽性與脈管內癌栓具有較大關系，說明腫瘤可侵襲患者的脈管系統(tǒng)，可為腫瘤的進一步轉移創(chuàng)造條件，及早測定外周血中CTCs 情況，能夠反映腫瘤的早期發(fā)生和轉移，可作為早期診斷胃癌的敏感指標[9]。CTCs 作為判斷腫瘤轉移的重要條件，能夠為乳腺癌、結腸癌等諸多惡性腫瘤的轉移預測及療效評定提供重要依據(jù)。由于CTCs 檢測具有安全無創(chuàng)、操作簡便以及特異性高等優(yōu)勢，CTCs 已經(jīng)成為評估腫瘤轉移風險的重要標志物。就目前來看，臨床可用于CTCs 檢測的方法較多，尤其隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，CTCs 的檢測呈現(xiàn)手段多樣化，基于免疫親和富集法和基于生物物理特性富集法是兩種最為常用的方法，敏感性和特異性均較高，臨床可根據(jù)具體需要選擇合適的檢測方法。本文研究過程中，采用了Cyttel 公司的CTCs 分離檢測技術，對90 例研究對象的外周血CTCs 情況進行檢測，結果顯示：研究組胃癌患者的CTCs 陽性率顯著高于良性疾病對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明采用該方法檢測具有較高的外周血CTCs檢出率，分析其原因可能在于：（1）Cyttel 法檢測能夠盡可能保留患者血樣本中的稀有細胞，最大限度去除了白細胞，以便更為準確地檢出外周血CTCs[10]。（2）在腫瘤細胞和健康血液中CD45 表達存在較大差異，在健康血液中該指標通常表達為陽性，在腫瘤細胞中會表現(xiàn)為陰性，且染色體前者為2 倍體，后者為多倍體，所以在檢測過程中稀有細胞的染色和雜交等處理充分利用了該特性，能夠顯著提升臨床對外周血CTCs 的檢出率[11]。（4）與傳統(tǒng)方法相比，Cyttel 法能夠有效減輕上皮-間充質轉化對細胞黏附因子的影響，有助于準確鑒別外周血CTCs，從而提升其陽性檢出率[12]。本研究顯示，胃癌患者的外周血CTCs 陽性與年齡、TNM 分期、性別、淋巴結轉移、分化程度無關，但是與患者的CEA、CA19-9、CA72-4 及脈管侵犯有關，說明胃癌患者的CTCs 高表達與脈管侵犯、腫瘤標志物水平有關，脈管侵犯的胃癌患者具有較高的遠處轉移風險。CEA、CA19-9、CA72-4 是臨床診斷胃癌的重要標志物，本研究結果也同樣證實，腫瘤標志物水平越高，患者的CTCs 陽性率越高，提示胃癌患者的腫瘤遠處轉移風險亦越高。由此可見，臨床可通過檢測患者的外周血CTCs 表達情況，及時了解患者的腫瘤發(fā)生以及轉移情況，進而為臨床診斷及治療方案制定提供有價值的參考信息。另外，通過監(jiān)測患者的外周血CTCs 表達情況，能夠為患者的個性化治療提供指導，從而增強臨床治療效果。

總之，CTCs 是胃癌患者腫瘤轉移的基礎，采用Cyttel 法能夠較為準確地檢出其外周血CTCs 陽性，且通過對其外周血CTCs 進行監(jiān)測，有助于準確預測胃癌患者的腫瘤轉移情況，具有較高應用價值。