NF-κB信號通路在椎間盤退行性變中的機制研究探討

葉嘉杰，姚嘯生，戚曉楠，鄭浩，于紅衛，路翀

（1.遼寧中醫藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110079；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院）

下腰痛（low back pain，LBP）是一種常見疾病，全世界約有6.37 億人受到影響。流行病學調查表明，下腰痛已經成為嚴重的醫療和社會問題，也是導致殘疾最常見的原因之一。據統計，大約80%的人群在一生中的某個時期會經歷腰痛，大約18%的人群隨時都可能遭受腰痛困擾［1-2］。現代研究發現，椎間盤退行性變（intervertebral disc degeneration，IDD） 是LBP 的主要誘因，同時是其他脊柱疾病，如椎間盤突出、脊椎病和腰椎狹窄的先期改變。IDD 是衰老過程的正常組成部分，其典型的特征是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）穩態受到干擾，因此基質合成代謝減少，分解代謝增加，椎間盤細胞外基質丟失［3］。有研究表明，IDD 與椎間盤組織中促炎細胞因子水平的升高有關，如白細胞介素（IL）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）［4］。

近年來，這些介導因子在IDD 中的基因表達和功能一直是研究的熱點。此外，在骨關節炎和類風濕性關節炎等領域的廣泛治療研究強調了識別潛在信號通路的必要性，促使大量IDD 研究人員探索導致IDD 炎癥和分解代謝的分子機制。核因子κB-（NF-κB）作為一種主要的細胞內通路，它可能在IDD 的發生和發展中起重要作用。本文總結了椎間盤中NF-κB 信號通路不同的激活機制以及NF-κB 可能的靶基因，對NF-κB 信號通路在IDD中機制研究進行探討。

1 LDD的相關表現

IDD 的發展以椎間盤微環境的細胞和生化改變為特征，導致進行性的功能和結構損害。椎間盤的機械功能由ECM提供，主要的機械作用是由膠原纖維和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）提供的。膠原纖維主要由I型和II型膠原纖維組成，其主要為椎間盤提供了抗拉強度。Aggrecan 是椎間盤的主要蛋白聚糖，通過其組成成分軟骨素和硫酸角蛋白鏈提供的滲透壓來維持組織水化［5］。

在健康椎間盤中，由于生長因子和分解代謝因子的復雜調控，ECM 的合成速率和分解速率是平衡的。當ECM分解超過其合成時，通常會發生IDD［6］。膠原蛋白和蛋白多糖的丟失在IDD的發展中起著關鍵作用，而基質金屬蛋白酶（MMPs）、新型金屬蛋白酶ADAMTSs 是分解膠原和蛋白聚糖的主要酶［7］。許多MMPs 和ADAMTSs 成員在IDD 組織和細胞中高表達，這些酶與ECM 破裂和IDD 進展密切相關［8］。隨著膠原成分的改變，髓核水分丟失，引起纖維環和終板的損傷，IDD 使促炎介質的產生，細胞衰老和死亡的增加，健康椎間盤細胞表型的改變，以及活躍細胞數量的減少，IDD由此產生。

2 NF-κB的結構和功能

2.1 NF-κB 的成員 在哺乳動物中，NF-κB 轉錄因 子 系 列 由NFKB1、NFKB2、RELA、REL和RELB編碼的五個成員P50、P52、P65（Rela）、c-Rel 和Relb 通過一個N 端DNA 結合/二聚結構域（稱為Rel 同源結構域）相互關聯［9］，其中最豐富的是p50：p65 異源二聚體，它控制著大多數NFκB上調基因的表達［10］。

2.2 NF-κB的抑制與激活 DNA結合NF-κB二聚體的活性被稱為IKB 亞基的附屬蛋白緊密控制。IκB在非刺激細胞的胞漿中保留NF-κB二聚體，并形成一個小家族，包括經典的IκBα、IκBβ、IκBε和非典型的BCL-3（B cell CLL/lymphoma 3），IκBζ，和IκBNS［11］。在大多數靜息細胞中，胞質抑制分子IκBα、β 和ε 以及前體P100 和P105 抑制活性NF-κB 的釋放，同時IkB 蛋白抑制DNA 結合并阻止NF-κB復合物的核轉移［12］。

許多不同的刺激可以激活NF-κB 轉錄因子來誘導其向細胞核聚集。大多數刺激激活的是經典的NF-κB 信號通路，主要影響的是p65：p50 和c-Rel：p50異二聚體。該通路圍繞著三聚體IκB激酶（IKK）復合物的激活。IKK 復合物包括兩個催化亞基IKKα 和IKKβ 以及一個稱為IKKγ 或NEMO（NF-κB Essential Modator） 的 調 節 亞 單 位 組成［11］。在各種刺激下，IKK 激活使IκB 磷酸化并導致其泛素化和隨后被泛素化蛋白酶體降解。IκB的降解使NF-κB 二聚體能夠移位到細胞核以誘導基因表達。由于NF-κB 本身還激活IκB 本身的表達，所以NF-κB 活化通常是瞬時的，持續大約在30～60 min［13］。

3 IDD中相關因素與NF-κB的激活

之前的研究已經證明了NF-κB 與退行性疾病的密切關系，如骨關節炎或骨質疏松癥。研究發現炎癥因子和氧化應激水平升高導致的NF-κB 活化；促炎因子水平升高致使NF-κB 活化導致IDD，而抑制NF-κB可以減緩IDD［14-15］。

3.1 IDD 中的炎癥因子與NF-κB 炎癥反應的不斷進行致使IDD 是目前的主流觀點之一。目前研究表明，與IDD 相關的主要致炎介質包括IL-1β、TNF-α、IFN-γ、PGE2等，以及一些不同的趨化因子［14］。在這些炎癥反應進程中，TNF-α和IL-1β的大量表達被認為是IDD 的關鍵，同時這兩個因子也是NF-κB激活的主要炎癥因子［4，15］。

3.1.1 IL-1β 激活NF-κB 信號通路的途徑 IL-1β的激活需要炎癥小體（NLRP）促進caspase-1 激活，然后將前體proIL-1β 裂解成mIL-1β 和IL-1βN端肽［16］。IL-1β通過激活IL-1β受體產生作用。IL-1β 受體是異二聚體復合物，由IL-1 受體輔助蛋白（IL-1RACP）和IL-1 受體類型I（IL-1RI）組成。在信號轉導過程中，IL-1RI 細胞外免疫球蛋白結構域與IL-1β 結合，形成專有的異源二聚體。然后，TIR 結構域招募IL-1RACP 形成IL-1β/IL-1RI/IL-1RACP配合物。該復合物結合銜接蛋白、髓樣分化因子88（MYD88），募集IL-1R 相關激酶4（IRAK4）之后，IRAK1由IRAK4磷酸化，隨后與TRAF6相互作用［17］。TRAF6激活轉化生長因子-β-活 化 激 酶1 （TAK1） 和TAK1 結 合 蛋 白2（TAB2），進而影響IKKα 和IKKβ，從而導致NFκB的核轉移［18］。

3.1.2 TNF-α激活NF-κB信號通路的途徑 TNF-α主要以跨膜型TNF-α（tmTNF-α）的形式產生。此外還有部分tmTNF-α 由金屬蛋白酶TNF-α 轉換酶（TACE）裂解成sTNF-α（可溶性形式）。TNF-α通過兩種不同的受體發揮作用：腫瘤壞死因子受體1（TNFR1，又稱p55）和腫瘤壞死因子受體2（TNFR2，又稱p75）。TNFR1 可被tmTNF-α 或sTNF-α激活，而TNFR2 主要由tmTNF-α 激活［19］。其中TNFR1 是腫瘤壞死因子-α 信號轉導的核心調節因子，在大多數細胞類型中都有組成型表達。

在tmTNF-α和sTNF-α刺激下，TNFR1從起抑制作用的SODD（silencer of death domain）蛋白中分離出來，TNFR1 可以結合TNF 受體相關死亡結構域（TRADD），并募集其他適配器蛋白質，包括TNF 受體相關因子2（TRAF2），受體相互作用蛋白-1 （RIP-1），細胞凋亡抑制蛋白1（CIAP1）和CIAP2形成復合體I［19-21］。隨后復合體I通過招募MEKK-3 并介導IKK 的激活，促進NFκB核轉位，導致多個靶基因的轉錄。TNFR2胞內區沒有死亡結構域，因此不能與TRADD結合。但是，它可以直接與TRAF2相互作用以招募TRAF3、TRAF1、cIAP1和cIAP2［22］。因此，TNFR2和TNFR1具有共同的信號效應，使NF-κB的激活。

3.2 IDD 中的缺氧適應性反應與NF-κB 椎間盤細胞生物學最重要的一個方面是，髓核細胞和內部纖維環內的細胞在血液供應中被移除。起源于椎體的血管穿過終板的淺表區域，這些血管均未滲入髓核。因此，髓核細胞處于無血管、缺氧的組織生態位［5］。有研究報道缺氧有助于炎癥的發展，至少部分是通過激活或增強NF-κB 這種參與先天免疫、炎癥和凋亡的細胞信號通路［23］。椎間盤髓核細胞對缺氧的適應性反應受缺氧誘導因子HIF-1α和HIF-2α調節。此外，HIF-1α和HIF-2α的水平主要受氧依賴的蛋白酶體降解控制，并由HIF的脯氨酸4-羥化酶結構域（PHD）家族的蛋白質催化［24］。

缺氧是IDD 的微環境特征之一，可通過多種方式影響炎癥的進展。HIF和NF-κB是兩種低氧應答轉錄因子，它們控制著適應基因和炎癥基因的獨立隊列，表現出高度的依賴關系。在慢性炎癥疾病中，組織缺氧導致PHD 活性降低，隨后激活HIF依賴的適應性基因表達。炎癥配體的信號傳導導致NF-κB 活化和隨后的炎癥和抗凋亡基因表達。兩種通路之間廣泛的交叉作用也存在，包括NF-κB依賴的HIF-1αmRNA表達上調，HIF依賴的NF-κB 活性調控及HIF-羥化酶對NF-κB 信號傳導的調控［25］。

3.3 IDD 中的氧化應激與NF-κB 退變性椎間盤的微環境以酸性pH、低營養、高滲透壓和炎癥為特征［26］。髓核細胞處于缺氧但不是完全厭氧的微環境中。髓核細胞對低氧微環境的適應能力較好，仍具有一定的氧化代謝水平。然而，伴有新生血管形成的退變性椎間盤的特征是氧張力增加，同時高氧伴隨的是髓核細胞中線粒體源活性氧（ROS）的產生，導致氧化應激和線粒體功能障礙，進而導致髓核細胞過度凋亡、衰老和ECM降解［27］。

根據目前的研究，退變椎間盤中ROS 的過量產生導致的氧化應激與NF-κB 途徑的激活息息相關。在線粒體ROS 觸發的分子機制中，NLRP3 炎癥小體因其在IDD 中的有害作用而被廣泛研究。NLRP3炎癥體的激活可以增加IL-1β的產生，會導致NF-κB 信號通路的激活與線粒體功能障礙，線粒體功能障礙又會加劇線粒體ROS和NLRP3炎性小體的激活［28］。Feng 等［29］通過對大鼠髓核細胞研究發現，Nox4，一種ROS 的生成酶，屬于NADPH 氧化酶（Nox）家族，在椎間盤中因高氧而大量表達，產生大量ROS，并可通過NF-κB 信號通路誘導髓核細胞的基質降解和炎癥的表達。Yao 等［30］發現高糖（HG）抑制劑可以抑制HG 誘導的ROS/NF-κB 途徑造成的機體髓核細胞損傷和ECM降解。

3.4 IDD 中的衰老與NF-κB 衰老與椎間盤的一系列退行性改變密切相關，衰老的椎間盤細胞是不可逆的細胞周期阻滯，由于細胞凋亡或壞死，導致功能性和活性椎間盤細胞數量的逐漸減少，最終纖維環破裂和椎間盤高度降低等［3］。基質蛋白多糖（PG）的丟失是椎間盤生物力學功能所必需的主要結構成分，也是椎間盤老化的另一個普遍特征。一項模擬研究發現，NF-κB 是與哺乳動物衰老最相關的轉錄因子，并證明NF-κB 效應器的一個子集的表達隨著年齡的增長而增加［31］。Nasto 等［32］在老化的椎間盤組織中發現了相比正常椎間盤升高的NF-κB 活性，敲除了NF-κB 亞基p65 等位基因的小鼠椎間盤細胞內PG 含量較未退變的椎間盤細胞有所增加，加入IKK 抑制劑8KNBD后發現作用與基因敲除類似，PG合成量較未處理的顯著增加，提示IKK/NF-κB 信號通路在老化引起IDD中起重要作用。

4 IDD中NF-κB的靶基因

目前已知在人體中有超過150個基因受NF-κB調控，其中包括幾種炎癥介質，如TNF-α、IL-1β、IL-6、（COX-2）、MMPs 和黏附分子等［33］。但在椎間盤中的靶基因還尚未完全可知。

IDD中有癥狀的椎間盤特征是炎癥因子水平升高，這些炎癥因子被認為是典型的NF-κB靶基因，例如TNF-α、IL-1β等［34］。同時有些炎癥因子也是NF-κB的活化因素，從而構建了一個正反饋回路。

Wang 等［8］總結了高表達的MMP 家族可能在促進IDD 的進展中發揮重要作用，其中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9 和MMP13 已經被鑒定為IDD 過程中的NF-κB 靶基因。ADAMTS 是一種新發現的金屬蛋白酶家族，ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS- 5、 ADAMTS- 7、 ADAMTS- 12 和ADAMTS-15 在IDD 組織中的表達明顯高于非退行性組織［35］。ADAMTS-4和ADAMTS-5因其高效裂解蛋白聚糖而被普遍認為是IDD 的主要侵襲性酶，并且認為其依賴于NF-κB 通路［36］。椎間盤中的iNOS/NO 和COX-2/PGE2 系統激活的信號通路被證明是ROS依賴的NF-κB通路，NO和PGE2均能抑制髓核細胞中aggrecan的合成，從而導致IDD中ECM的破壞［37］。

除了對ECM 相關蛋白酶的調控，NF-κB 還靶向一些細胞因子發揮調控作用。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1），一種巨噬細胞的趨化因子，在小鼠IDD 細胞中的表達受到NF-κB 途徑的調節［38］。Gu 等［39］對椎間盤髓核細胞的體外研究發現內毒素引起的NF-κB 核轉移，誘導促炎細胞因子釋放，從而促進細胞因子TGF-β 的活化。此外，抵抗素通過NF-κB信號通路與TLR4結合，上調趨化因子配體4（CCl4）在髓核細胞中的表達，導致巨噬細胞浸潤［40］。

在IDD 中活化NF-κB 還可能促進多種凋亡調節因子的表達，如凋亡調節因子P53 和其下游BH3-Only Bcl-2 家族成員凋亡調節因子（PUMA）都與NF-κB密切相關［41-42］。

5 小結與展望

隨著人口老齡化的加劇，IDD 必將成為現在乃至將來的熱點問題。IDD 一直是骨科重點研究方向，根據現有的國內外文獻研究，NF-κB 通路的研究是具有科研和臨床實踐價值的。NF-κB 可由椎間盤內多種因素（包括炎癥因子、缺氧、氧化應激和衰老等）激活，同時我們也總結了IDD中NF-κB 的靶基因（包括炎癥因子、ECM 相關蛋白酶、免疫因子以及凋亡相關基因等）。

通過靶基因研究，我們可以得到IDD 中的某些病理生理變化是由NF-κB 信號通路所介導的。此外，通過椎間盤內NF-κB 激活途徑的研究可以幫助我們找到抑制NF-κB 通路激活的關鍵環節，從而開發具有特異性NF-κB 信號抑制劑或者通過調控NF-κB 上游激活因素來達到對NF-κB 的抑制作用，對于預防和治療IDD 具有重要意義。我們對于NF-κB 通路的基礎研究還需進一步深入，未來藥物學研究以及生物分子調控將被用于IDD，相信更好的療效及更低的副作用的手段將幫我們更好地應對IDD的發生。