新煙堿類殺蟲劑對人類及哺乳動物的生殖毒性作用

馬躍，毛亞萍，劉芙，宋月清，柴琳青，王鑫，袁寧，馬明月

（1.沈陽醫學院2018級本科生；2.公共衛生學院衛生檢驗學教研室；3.2019級本科生；4.公共衛生學院毒理學教研室）

新煙堿類殺蟲劑（neonicotinoids，NEOs）是一種廣譜殺蟲劑，自1991年第一種NEOs——吡蟲啉（imidacloprid，IMI）開發以來，已發展成為世界上使用最廣泛的一類殺蟲劑，常用于農業、園林綠化和家庭寵物中的昆蟲防治［1］。NEOs主要包括IMI、啶蟲脒（acetamiprid，ACE）、噻蟲胺（clothianidin，CLO）、噻 蟲 啉（thiacloprid，THD）、噻蟲 嗪（thiamethoxam，THM）、烯啶蟲胺（nitenpyram，NIT）和呋蟲胺（dinotefuran，DIN）等［2］。其作為激動劑，通過選擇性作用于昆蟲神經系統突觸后膜的煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs），使昆蟲異常興奮，最終導致全身痙攣麻痹而死亡［3］。因其對哺乳動物nAChRs親和性較低，該類殺蟲劑對哺乳動物毒性較低，可替代傳統殺蟲劑（有機氯類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等），且與其不發生交互抗性［2］。但由于NEOs分子量低，水溶性較高，不容易發生水解，具有很強的內吸性，因此容易在土壤、水體、農作物中殘留，并通過飲水、飲食、皮膚接觸等途徑進入人體［4］，從而導致人群的廣泛暴露，對人類健康產生不利影響。流行病學研究的有限數據確定了NEOs的急性和慢性健康影響，特別是母親孕期NEOs暴露對后代的影響，包括呼吸道疾病、心血管疾病和神經系統疾病，以及氧化遺傳損害和先天缺陷等［5］。動物模型研究表明，NEOs暴露可導致遺傳毒性、神經毒性、免疫毒性和生殖毒性等［2，4］。本文主要對NEOs暴露對人類及哺乳動物的生殖毒性作用及其機制研究進展進行綜述。

1 NEOs對人類的生殖毒性作用

1.1 NEOs 在人群中的暴露水平 NEOs 的廣泛應用，以及食物、飲水中NEOs的普遍存在，不可避免地導致了人體的累積暴露，特別是農民和農藥經營者。Chen 等［6］根據第五次（2009-2012 年）和第六次（2015-2018 年） 中國總膳食研究（CTDS）收集的復合飲食樣本（528 個），研究了中國成年人飲食的NEOs 暴露情況，確定了10 種NEOs 水平，其中ACE 和IMI 是最常檢測到的NEOs；總NEOs的平均估計每日攝入量（EDI）分別為598.95 和710.38 ng/kg。鑒于食物中NEOs 的普遍存在，其可能導致的健康風險不容忽視。Zhang 等［7］測定了我國13 個城市共324 名志愿者的 尿 液 樣品 中6 種NEOs （CLO、THM、IMI、DIN、ACE、THD）水平，發現NEOs檢測率均達92%以上，體現了人群NEOs暴露的普遍性；且男性尿液樣品NEOs水平顯著高于女性。有研究顯示兒童是NEOs暴露的易感人群。Osaka等［8］對日本223 名3 歲兒童的尿液樣本中的7 種NEOs 進行了檢測，檢出率較高的是DIN、THM 和NIT，分別為58%、25%和21%，IMI和ACE的檢出率分別為15.2%和12.1%，夏季尿液樣品中總NEOs 濃度顯著高于冬季。陶燕［9］對河南果園種植區共617人的尿液中吡蟲啉及其代謝物6-氯煙酸進行檢測，發現農區居民尿液中目標物濃度均高于城區居民；農區青少年和老年人暴露濃度相對較高；農區兒童暴露濃度顯著高于城區兒童，相差3.30～4.49倍，年齡越小的兒童暴露風險越高。以上流行病學研究顯示，NEOs的廣泛應用導致了人群的廣泛暴露，DIN、IMI和ACE等檢測率均較高，農民、農藥經營者及兒童的暴露風險更高。NEOs的長期累積暴露對人體健康的潛在影響不可忽視。

1.2 NEOs 對人類的生殖毒性作用 NEOs 累積暴露對人類健康影響的流行病學研究揭示了其慢性毒性作用。有研究發現，NEOs暴露與記憶力減退和手指震顫等神經癥狀的產生［10］、肺功能障礙［11］等存在相關性。目前NEOs對人類生殖系統的毒性作用，特別是孕期NEOs暴露對后代生殖系統的影響的研究極少。Suwannarin 等［12］對泰國北部143名男性農場工人（18～40 歲）的尿液NEOs 及其代謝物進行檢測，發現超過60%樣本中檢測到NEOs代謝物，線性回歸分析顯示，IMI水平與睪酮、脫氫皮質酮和脫氫表雄酮水平呈正相關；吡蟲啉-烯烴和脫氫表雄酮水平呈正相關；THM與脫氫皮質酮和脫氧皮質酮水平呈負相關；CLO、THM和N-去甲基-啶蟲脒水平與雄烯二酮水平呈正相關，結果表明，NEOs暴露可影響類固醇的生成。

NEOs對人類的生殖發育毒性的研究主要體現在孕期NEOs 暴露對后代發育的影響。Ichikawa等［13］分析了極低出生體重兒的NEOs 暴露情況，在出生后48 h內收集的57個尿液樣本中N-去甲基啶蟲脒的檢測率為24.6%，出生后第14天的65個樣本中N-去甲基啶蟲脒的檢測率為11.9%，小于胎齡兒中尿N-去甲基啶蟲脒的檢出率和水平均高于適于胎齡兒（P＜0.05）。Keil等［14］對孤獨癥譜系障礙（ASD）兒童與母親IMI暴露情況的關聯性進行了研究，研究納入407例ASD兒童和262例健康對照組，發現ASD 兒童產前IMI 暴露的概率稍高（OR=1.3，95%CI：0.78～2.2）。有研究者對美國加利福尼亞州殺蟲劑應用區域的出生缺陷發生風險與妊娠早期殺蟲劑暴露的相關性進行了研究，發現無耳畸形（OR=3.0，95%CI：1.4～6.6）、肢體橫向缺陷（OR=2.9，95%CI：1.1～7.4）、顱縫早閉癥（OR=3.5，95%CI：1.5～8.3）、無 腦 畸 形（OR=2.9，95%CI：1.0～8.2） 發生風險與IMI 暴露相關［15-16］，法洛四聯癥發生風險與NEOs 暴露相關（OR=2.4，95%CI：1.1～5.1）［17］。

綜上所述，NEOs暴露可對人類健康產生不良影響，與神經系統癥狀、呼吸系統癥狀發生相關。孕期NEOs暴露與不良出生結局相關，包括極低出生體重兒，以及ASD、先天性心臟病、先天性無腦畸形等。但NEOs暴露對人類生殖系統毒性作用研究較少，并且NEOs暴露對人類健康不良影響的可能機制仍不明確。

2 NEOs對哺乳動物的生殖毒性作用

目前，NEOs的毒性作用及相關機制主要通過動物模型進行研究，涉及神經毒性、肝毒性、生殖毒性等。NEOs可與哺乳動物的神經元α7和α4β2 nAChRs結合，發揮神經毒性作用［18-19］。而哺乳動物nAChRs不僅在神經系統中表達，還可在睪丸精子細胞、間質細胞、支持細胞、精原細胞、精母細胞、胎盤等中均有表達［20］。目前已有多項研究報告了NEOs暴露對哺乳動物生殖系統的不良影響。

2.1 NEOs 的雄性生殖毒性作用 目前已有多項研究揭示了NEOs 暴露對雄性生殖系統的損害。IMI 和ACE 暴露可導致大鼠和小鼠的體重和生殖器官（睪丸、附睪、精囊、前列腺）的重量顯著下降，睪酮濃度以及精子數量、活力、頂體完好度顯著降低，精子DNA片段化，促性腺激素釋放激素、促黃體生成素、卵泡刺激素水平升高［21-23］；還可對小鼠精子的受精能力和胚胎發育產生不利影響［24］。ACE暴露可導致未成熟小鼠睪丸中睪酮代謝基因（Lhr、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd17b1）、nAChRs亞基（α4、β2、α7）基因、細胞增殖相關基因（Ki67、Top2a）表達下降，但不影響垂體中LHβ和FSHβ基因的表達水平；并且可檢測到血清和睪丸中ACE 水平顯著上升［25］。目前關于孕期NEOs 暴露對子代發育影響的研究較少。Yanai等［26］評估了小鼠孕期和產后早期（GD1～PND14）CLO 暴露［10、50 mg/（kg·d）］對后代雄性生殖毒性的影響，發現CLO 暴露導致雄性子代睪丸重量和精子數量降低，但不影響睪丸類固醇的生成水平、睪丸間質細胞凋亡數量和增殖活性。Burke 等［27］評 估 了 小 鼠 孕 期 和 產 后 早 期（GD4～PND21）IMI暴露［0.5 mg/（kg·d）］對子代的影響，發現IMI暴露降低了母鼠的繁殖力，且成年子代雄鼠運動能力增加，體重降低，但不影響成年雌鼠體重；在母鼠的大腦和肝臟中可檢測到低水平的IMI，而在一些后代中檢測到痕量IMI水平，這表明IMI可以從母鼠轉移到幼鼠。

2.2 NEOs 的雌性生殖毒性作用 NEOs 的雌性生殖毒性作用主要表現在其對卵巢的毒理學作用。Kapoor 等［28］研究發現，IMI［20 mg/（kg·d）］對雌性大鼠的卵巢產生了明顯不良影響，其表現為卵巢重量減少，卵泡、竇狀卵泡和閉鎖卵泡的病理形態學變化明顯；增加發情期持續時間，從而擾亂發情周期；促黃體生成素和孕酮水平下降，卵泡刺激素水平上升；同時誘導氧化應激產生。還有研究發現，雌性大鼠孕期IMI暴露［10 mg/（kg·d）］可導致子代雌二醇和孕酮水平下降，卵巢重量和直徑減少，卵泡數量減少，子代交配成功率及其胚胎數量降低，以及DAX1 基因表達降低［29］。

以上結果表明，NEOs暴露對哺乳動物雌性和雄性生殖系統及胚胎發育均有損害。目前評估孕期NEOs暴露對后代生殖發育影響的研究較少，相關調控機制仍不明確。以動物模型實驗進行作用機制的深入研究，有助于揭示孕期NEOs暴露與潛在的生殖健康效應。

3 NEOs生殖毒性的可能機制

3.1 氧化應激 研究顯示，NEOs 暴露誘導的氧化應激在其對非靶標物種的毒性中起著重要作用。IMI暴露可導致雄性大鼠睪丸中以及雌性大鼠卵巢中脂質過氧化物顯著增加，谷胱甘肽水平降低，同時過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽巰基轉移酶活性降低，導致雄性大鼠睪酮水平以及雌性大鼠促黃體生成素、卵泡刺激素和孕酮水平紊亂［23，28］。IMI 暴露也可導致雌性大鼠肝、腎和腦中產生氧化應激［29］。ACE暴露也可引起氧化應激反應，導致睪丸中丙二醛和一氧化氮水平顯著增加，而過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶含量顯著降低，并激活了p38 MAPK 通路，進而導致睪丸間質細胞的內質網和線粒體受損，ATP 和cAMP的產生降低，從而降低了cAMP依賴性蛋白Star、HSD3B、Cyp11a1 的mRNA 和 蛋白表達水平，并影響了類固醇激素的合成［21-22］。研究報道，抗氧化物（維生素C、維生素E、姜黃素等）可改善IMI和ACE誘導的氧化應激損傷［21，23］。

3.2 影響類固醇的生物合成 環境內分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs） 可 模擬或拮抗內源激素，結合類固醇激素核受體，干擾相關基因轉錄過程，這可能是NEOs 作為EDCs 發揮生殖毒性作用的一種機制。有研究揭示了NEOs和類固醇激素核受體的相互作用。Zhang 等［30］評估了THD和IMI作為EDCs的潛在作用，發現在相對較高的濃度下（＞10-4mol/L），IMI 可通過結合雌激素受體（ERα）誘導劑量依賴的雌激素效應。Yuan等［31］研究發現，IMI 暴露可導致小鼠睪丸重量顯著降低，睪丸形態嚴重受損，血清睪酮和雌二醇水平顯著下降，睪丸雄激素受體的表達也顯著下降；血清膽固醇來源減少，膽固醇合成限速酶HMG-CoA合成酶表達顯著降低；分子對接結果分析表明，IMI成功地對接至雄激素受體的活性位點，且IMI和雄激素受體之間具有穩定的結合；數據表明，IMI可通過與雄激素受體相互作用而導致內分泌破壞。

芳香化酶是可催化雄激素轉化為雌激素。NEOs對芳香化酶活性的影響，也可能導致內分泌紊亂。在體外胎兒胎盤類固醇生成模型中，IMI處理可誘導芳香化酶（CYP19）活性，并發現增加雌酮和雌二醇水平，而降低雌三醇水平；還發現IMI 可誘導CYP3A7 的表達，CYP3A7 通常在胎兒肝臟中表達，是參與雌三醇合成的關鍵酶，IMI可能被CYP3A7 代謝，抑制胎兒硫酸脫氫表雄甾酮的16α-羥基化，進而影響其向雌三醇的轉化，這可能是雌三醇減少的原因［32］。在一項評估IMI 對雄性內分泌系統的毒性作用研究中，發現IMI暴露可導致小鼠血清芳香化酶活性顯著降低［33］。NEOs對芳香化酶活性的影響可能是其生殖毒性的重要機制。

綜上所述，NEOs的廣泛應用導致了人群的廣泛暴露，且兒童的暴露風險更高。母親孕期NEOs暴露與呼吸道疾病、神經系統疾病、先天性心臟病和先天性無腦畸形等的發生相關。但NEOs對人類健康的潛在影響仍不明確，很多尚無肯定的結論。動物模型和體外實驗結果揭示了NEOs暴露對哺乳動物雌性生殖系統和雄性生殖系統的損傷，NEOs導致生殖損傷的機制之一是氧化應激，其他可能信號通路研究較少，其毒性作用機制仍不十分明確。目前關于母親孕期暴露對子代生殖系統影響的研究較少，其潛在影響及相關機制仍需深入研究。相關機制的深入研究有助于篩選新的敏感性分子生物標志物，從而能夠評價NEOs對人體健康的不良影響；更有助于探索保護職業暴露人群（如農民和農藥經營者）免受NEOs毒性作用的方法。