6-甲基腺嘌呤RNA甲基化與眼科疾病的研究進展

楊相穎, 安 寧, 譚 耀, 陳 勝,劉靜雯, 張福燕, 秦 波

(1. 貴州醫科大學 臨床醫學院, 貴州 貴陽, 550004;2. 暨南大學附屬深圳愛爾眼科醫院 眼底病眼外傷科, 廣東 深圳, 518032;3. 廣東省深圳市眼科醫院 眼外傷科, 廣東 深圳, 518040)

6-甲基腺嘌呤(m6A)RNA甲基化修飾能夠影響靶基因的表達，參與了幾乎所有的RNA代謝過程，能夠調節多種生理過程，包括自我更新、侵襲和增殖[1]。轉錄后修飾主要涉及了3組酶調控，即甲基轉移酶、甲基化閱讀蛋白和去甲基化酶。甲基轉移酶包括甲基轉移酶樣3(METTL3)、甲基轉移酶樣14(METTL14)、甲基轉移酶樣16(METTL16)、RNA結合基元蛋白15(RBM15)、病毒樣m6A甲基轉移酶相關蛋白(VIRMA)、Wilms′tumor-1結合蛋白(WTAP)、CCCH 型鋅指蛋白(ZC3H13)等，主要作用是催化RNA上腺苷酸，發生m6A RNA甲基化。甲基化閱讀蛋白包括真核起始因子3 (EIF3)、異質核核糖核蛋白A2B1 (HNRNPA2B1)、異質性胞核核糖核蛋白C (HNRNPC)、胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白 (IGF2BPs)、YT521-B(YTH)同源結構域家族(YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3), 主要作用是參與mRNA的翻譯、加工及降解。去甲基化酶包括肥胖相關蛋白(FTO)和ALK b同源蛋白5(ALKHB5), 主要作用是對已發生m6A甲基化的RNA堿基進行去甲基化修飾[2]。m6A RNA甲基化還能夠調控其他RNA[3], 如核糖體RNA (rRNA)、轉運RNA (tRNA)、小核RNA (snRNA)、微小RNA (miRNA)、環狀RNA (circRNA)、長鏈非編碼RNA (LncRNA)等，這些m6A RNA甲基化在各種生理和病理生物過程中發揮重要作用。目前研究[4]發現, m6A RNA甲基化修飾在許多眼部疾病的發生、發展中發揮著重要作用。隨著研究的深入，眼科常見疾病的發病機制將進一步被闡釋, m6A RNA甲基化可能成為研究眼科領域可靠的生物標志物。

1 m6A RNA甲基化與白內障

研究發現，年齡相關性白內障(ARC)的形成和發展與晶狀體上皮細胞(LEC)中某些基因的表觀遺傳修飾有關。與正常眼相比, ARC的LEC中5個相關基因的mRNA和蛋白質表達水平增高[5]。已知circRNA在人類晶狀體組織中具有一定表達譜及潛在功能，只有少數circRNA的功能在白內障中得到闡明，例如circRNA可以通過miRNA在白內障中表達，其中環狀RNA HIPK3(circ-HIPK3)通過環狀RNA HIPK3/微小RNA 193a/重組人α晶狀體蛋白A鏈(circHIPK3/miR-193a/CRYAA)通路調節人類LEC增殖和凋亡。環狀RNA KMT2E(circKMT2E)的上調可能通過海綿化微小RNA miR-204-5p(miR-204-5p)參與糖尿病白內障的發病機制[6]。研究[7]發現, circRNA修飾的上游調控機制可能與m6A RNA甲基化相關。在年齡相關性皮質性白內障(ARCC)中, circRNA的m6A RNA甲基化大幅度降低。在5種主要甲基轉移酶中, ALKBH5在ARCC的LEC中顯著上調，提示晶狀體組織中甲基轉移酶表達的改變可能通過調節circRNA選擇性地改變晶狀體基因組的表觀遺傳譜, ALKBH5及circRNA兩者表達增高使ARC的易感性增加，這是ARC一個新的發病機制的分子靶點。單純性核性白內障患者和高度近視的核性白內障患者晶狀體前囊膜內m6A RNA甲基化和基因表達也存在差異。m6A的去甲基化蛋白ALKBH5在高度近視核性白內障中表達下降，并通過編碼蛋白質來調節細胞外基質的組成，從而使晶狀體的結構發生改變。METTL3在糖尿病性白內障(DC)組織標本和高血糖誘導的LEC中上調，降低METTL3表達能促進高糖誘導的LEC的增殖并抑制其凋亡。

2 m6A RNA甲基化與增殖性玻璃體視網膜病變

增生性玻璃體視網膜病變(PVR)是一種難治性玻璃體視網膜纖維化疾病，視網膜色素上皮(RPE)細胞的上皮間質轉化(EMT)是PVR的重要病理機制。研究發現, METTL3參與了PVR過程, METTL3過表達通過誘導細胞周期停滯于G0/G1期而抑制細胞增殖，在體內可抑制PVR過程。METTL3過表達還通過調節Wnt/β-catenin通路減弱轉化生長因子β1(TGFβ1)觸發EMT的能力，而METTL3基因敲除后能夠促進ARPE-19細胞的增殖和EMT。大鼠的玻璃體內過表達的METTL3與對照組相比，實驗組PVR的發生較對照組延遲[8]。除了METTL3之外，甲基轉移酶ALKBH5和METTL14也參與EMT過程，兩者表達增加使YTHDF3表達水平降低, m6A RNA甲基化水平降低和TGFβ1表達增加, TGFβ1增加了上皮間質轉化，同時還能誘導血管生成因子促進新生血管形成。

3 m6A RNA甲基化與糖尿病視網膜病變(DR)

DR是糖尿病的主要微血管并發癥，已成為嚴重威脅視力的疾病。炎癥、氧化應激和血管生成以及最近發現的神經退行性變[9]是驅動DR發病的主要因素。研究發現, DR過程中檢測到m6A RNA甲基化水平升高，且各種非編碼RNA如miRNA、LncRNA和circRNA也與DR相關。已有研究[10]證實m6A通過影響這些非編碼RNA的剪接和成熟參與影響機體代謝。代謝記憶(遺留效應)是一種與糖尿病相關的現象，指即使血糖恢復正常后，其也不能降低患糖尿病相關并發癥的風險。研究[11]表明, m6A RNA甲基化在該病的進展、發病機制與代謝記憶現象存在關聯。

3.1 m6A RNA甲基化與DR炎癥

DR患者血液和眼部樣本中各種炎癥細胞因子水平升高[12]。T細胞是炎癥的主要調節細胞。METTL3基因缺失可導致T細胞中m6A RNA甲基化水平降低，增加細胞因子信號轉導抑制基因(SOCS)家族基因的mRNA和蛋白水平使T細胞增殖和分化得到限制。SOCS家族基因編碼信號傳導及轉錄激活蛋白(STAT)抑制蛋白，從而抑制STAT5激活，而STAT5激活是T細胞擴增的關鍵步驟之一[13]。此外, METTL3介導的m6A RNA甲基化能夠通過增強樹突狀細胞的功能激活T細胞，同時提高炎癥反應的有效介質核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路和白細胞介素-12(IL-12)的生成[14], 提示m6A RNA甲基化增加能夠使T細胞增殖分化，使機體炎癥因子增加。DR中早期病理變化之一是視網膜中周細胞丟失，葡萄糖誘導視網膜細胞中NF- κB活化增加，并促進細胞凋亡，導致周細胞丟失。METTL3過表達也可通過YTHDF2依賴性mRNA衰減介導抑制蛋白激酶Cη(PKCη)、脂肪非典型鈣黏蛋白4(FAT4)和血小板源性生長因子受體(PDGFRA)表達來損害周細胞功能[15]。敲除甲基化閱讀蛋白YTHDF2的能增加MAPK和NF- κB信號通路[16]。敲低m6A去甲基化蛋白FTO會增加炎癥介質干擾素γ(IFN-γ)的表達[17], 表明m6A RNA甲基化修飾與炎癥反應相關。DR中甲基轉移酶相關基因表達上調，去甲基化酶表達下調，相關m6A RNA甲基化增加，促使炎癥反應增加，提示降低m6A RNA甲基化水平可減輕DR中的炎癥反應。

3.2 m6A RNA甲基化與DR中氧化應激

氧化應激在DR發展中起關鍵作用。糖尿病的代謝異常導致大小血管內皮細胞中的線粒體超氧化物過量產生。增加的細胞內活性氧(ROS)會導致血管生成障礙，進一步導致組織缺血，激活炎癥通路，并導致時間較長的表觀遺傳變化，在血糖控制正常后仍然能夠使促炎基因持續表達(遺留效應)。視網膜不飽和脂肪酸含量高，攝氧量和葡萄糖氧化水平高于其他組織而對氧化應激高度敏感。轉基因糖尿病小鼠中超氧化物歧化酶的過表達可預防DR[18]。順式二甲基二氯鉑(DDP)誘導的氧化應激, YTHDF1低表達能降低KELCH樣ECH關聯蛋白1(KEAP1)的轉錄及翻譯效率，相反YTHDF1過表達能激活抗氧化基因的關鍵調控因子之一紅系衍生的核因子2相關因子2(Nrf2)[19]。過表達YTHDF1使KEAP1表達減少，使Nrf-2蛋白表達增加, Nrf-2核轉位使其發揮抗氧化功能，ROS生成減少。mRNA翻譯過程中因翻譯停滯產生的應激顆粒會誘導氧化應激[20]。應激顆粒的組裝和拆卸受到各種翻譯后修飾以及許多核糖核蛋白(RNP)或蛋白質復合物的調節。生理條件下，m6A RNA甲基化修飾需要3個非翻譯區(UTR)和停止密碼子，而在氧化應激中可觀察到5個UTR和5個編碼序列(CDSs, 含有最多的DRAC基因片段附近m6A的動態修改，說明mRNA翻譯中m6A RNA甲基化在氧化應激狀態下更為普遍[21]。應激狀態下，氧化應激能使mRNA翻譯停滯, m6A RNA甲基水平增加化能使翻譯重新啟動，提示m6A RNA甲基化在調節關鍵的抗氧化應激防御系統中發揮重要作用，增加相關基因m6A RNA甲基化可能在DR中起到保護作用。

m6A RNA甲基化在DR的炎癥反應及氧化應激中均起作用，在DR的氧化應激中修飾水平升高能夠促進炎癥的發生，但同時也能減少氧化應激反應，主要原因是提高m6A RNA甲基化水平增加了炎癥因子表達的同時增加了抗氧化酶的表達。

4 m6A RNA甲基化與高度近視

高度近視是一種發病率較高的致盲性疾病，嚴重影響患者的生活質量。近視的病因很復雜，主要是遺傳因素和環境影響之間的相互作用的結果。研究表明，家族遺傳因素及環境因素各占有一定比例。高度近視眼軸增長，脈絡膜變薄，部分區域的脈絡膜毛細血管丟失提示脈絡膜循環可能在視網膜功能障礙和視力喪失中起重要作用。目前，研究發現, m6A RNA甲基化與高度近視的發病機制密切相關。基因本體論(GO)數據庫分析顯示，編碼含有m6A RNA甲基化峰值的相關基因上調也與循環系統發育、血管發育密切相關，提示高度近視患者眼底m6A RNA甲基化水平升高可能通過影響脈絡膜循環而對眼底造成損害[22]。后鞏膜葡萄腫是高度近視眼解剖學中最基本的改變之一。高度近視眼中甲基化酶(METTL14)的上調和去甲基酶(FTO和ALKBH5)的下調催化CHI3L1基因的高甲基化，影響其編碼幾丁質酶樣蛋白-40(YKL-40)的表達水平，從而調節細胞外基質的組成促進高度近視的病理狀態。增加的m6A RNA甲基化可能通過影響細胞外基質成分而參與后鞏膜葡萄腫的形成[23]。

5 m6A RNA甲基化與眼部血管

血管生成異常是許多眼科疾病的重要特征，包括DR、老年黃斑變性(AMD)、早產兒視網膜病變(ROP)和角膜疾病。由于缺少壁細胞和基底膜，新生血管脆弱、易滲漏、易出血，容易發生不可逆轉的視力障礙甚至失明。臨床常通過消融缺氧的視網膜來抑制視網膜病理性血管生成。視網膜血管生成通常是由缺氧引起的基因失調所驅動的，但其特征、調控機制和在病理性血管生成中的作用尚不清楚。METTL3沉默或METTL3過表達能改變內皮細胞的活力、增殖、遷移和血管形成。沉默METTL3基因能使缺氧誘導的視網膜病變模型中的無血管面積和病理性新生血管減少，并抑制堿燒傷誘導的角膜新生血管形成(CNV)[24]。CNV模型中m6A修飾水平降低。METTL3的過表達介導的m6A RNA甲基化在缺氧條件下通過顯著增加Wnt信號通路來促進眼部血管生成[25]。甲基轉移酶復合物的關鍵亞基Wilms腫瘤1相關蛋白(WTAP)表達降低可通過減少橋粒斑蛋白(DSP)基因的m6A RNA甲基化調節而抑制內皮細胞血管生成。WTAP表達降低也導致β-連環蛋白的大量降解，從而抑制內皮細胞及血管生成[26]。METTL14和ALKBH5通過影響彼此的表達來抑制甲基化閱讀蛋白YTHDF3來確定靶基因的m6A RNA甲基化狀態, ALKBH5和METTL14表達增加以及YTHDF3表達水平降低使RNA的m6A甲基化水平降低和TGFβ1表達增加, TGFβ1通過誘導血管生成因子促進新生血管形成[27]。轉化生長因子β(TGF β)是導致DR微血管病變的主要因素，因此改變其轉化效率和穩定性對DR具有重要作用。

FTO具有高效的氧化去甲基化酶活性。在病理條件下，新生血管化角膜和內皮細胞中的FTO水平增高。在體外內皮細胞中，沉默FTO基因可使細胞增殖、遷移和血管形成減少。在體內, FTO沉默能減少縫線誘導的CNV。內皮細胞中沉默FTO后增加了關鍵促血管生成基因黏著斑激酶(FAK)的m6A RNA甲基化水平，導致RNA穩定性降低并通過m6A甲基化閱讀蛋白YTHDF2增加RNA衰變來減少新生血管的生成。

FTO通過以YTHDF2依賴性方式控制內皮細胞功能來調節病理性血管生成。增加甲基轉移酶在體內的表達能夠促進m6A RNA甲基化水平，導致眼部新生血管生成。甲基轉移酶過表達后在一定程度上會影響甲基化閱讀蛋白的表達水平，主要表現為甲基化閱讀蛋白表達的下降進一步抑制m6A RNA甲基化。目前研究結果顯示，甲基轉移酶、甲基化閱讀蛋白、去甲基化酶之間的表達水平相互影響，這3種蛋白酶表達升高的總體結果使新生血管生成增加。

6 m6A RNA甲基化與視神經損傷

創傷性視神經損傷導致視網膜神經節細胞(RGC) 功能障礙和死亡、進行性視力障礙是不可逆失明的主要原因。迄今為止，當前的藥物或手術治療還不能使視力完全恢復，軸突再生對于視神經損傷后視力的功能恢復至關重要。視神經損傷后, RGC軸突通常無法再生。視神經損傷后軸突再生的詳細的分子機制知之甚少。研究發現，在視神經損傷早期，視網膜組織mRNA中存在大量m6A RNA甲基化的差異性表達[28]。缺血-再灌注(OGD/R)模型誘導神經元損傷，刺激METTL3介導的長鏈非編碼RNA D63785(LNC-D63785)的m6A RNA甲基化，使LNC-D63785下調，致miRNA miR-422a的積累進而使神經元細胞顯著凋亡。沉默METTL3或Lnc-D63785能逆轉氧糖剝奪再灌注(OGD/R)誘導的Lnc-D63785 m6A RNA甲基化，降低微小RNA 422a(miR-422a)的積累，減少神經元細胞凋亡[29]。m6A甲基轉移酶復合物METTL14和YTHDF1的缺失會減少神經損傷中的蛋白質翻譯，并減少體內周圍神經系統的功能性軸突再生。METTL14低表達后，中樞神經系統中PTEN缺失誘導的視網膜神經節神經元軸突再生減弱[30], 提示m6A RNA甲基化在創傷性視神經病變中的差異性表達和誘導軸突再生的表觀轉錄組學中具有關鍵作用。

7 m6A RNA甲基化與眼部腫瘤

葡萄膜黑色素瘤(UM)是最常見的成人眼內腫瘤，超過一半的患者在5年后發生轉移，結膜黑色素瘤(CM)也是一種罕見且致命的疾病，近30%的患者在10年內死亡。研究提示, m6A RNA甲基化在眼黑色素瘤組織中的表達降低，而過表達的METTLE3或YTHDF1能促進腫瘤抑制因子組氨酸核苷酸結合2(HINT2)的m6A RNA甲基化修飾及蛋白翻譯[31]。但是也有研究[32]發現，敲低的細胞色素C(Cyc)或METTL3能下調UM細胞中的酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)等和細胞周期相關蛋白水平，通過細胞周期G1停滯抑制UM細胞增殖和集落形成，以及抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。ALKBH5去甲基化酶在葡萄膜黑色素瘤(UM)細胞中表達顯著升高, AKLBH5誘導的叉頭框蛋白M1(FOXM1) mRNA的m6A去甲基化促進UM中上皮間質轉化，并促進UM轉移mRNA, 增加其表達和穩定性。下調ALKBH5能抑制UM細胞的增殖、遷移和侵襲，并在體外增加了細胞凋亡[33]。因此，AKLBH5是UM預后及治療中潛在的標志物和治療靶點。

8 小 結

DR、眼部退行性變及新生血管、視神經病變、高度近視、玻璃體增殖性病變、白內障、眼部腫瘤等眼部疾病受到外部環境因素、遺傳因素及表觀遺傳學因素等共同影響。研究提示, m6A的甲基化修飾水平在眼部疾病中發揮著重要作用，但其具體功能及作用機制還需要進一步探索及闡明，如Graves′眼病中WTAP、YTHDF2、YTHDC2表達升高，但具體機制不明。本文主要闡述m6A RNA甲基化在常見眼部疾病中的調節作用，在其他眼部疾病中的調節機制仍有待進一步研究。隨著人們對眼科疾病發病機制的深入認識, m6A RNA甲基化修飾可能成為闡明相關眼科疾病的發生、發展新的視角，特別是在氧化應激領域。研究[34]已經證實, m6A RNA甲基化與細胞氧化應激密切相關，可能是由HO-1介導的通路，但具體下游信號通路尚需進一步驗證。