蘇黃止咳膠囊提取物多糖含量的測定方法研究

李超 豐杰 鄭悅 張海平 劉小清

蘇黃止咳膠囊源于國醫大師晁恩祥教授“風咳”理論名醫名方[1]，是“風咳”證獨家治療藥物，申請到了“風咳”適應癥的專利，保護期為 20 年。是針對感冒后咳嗽和咳嗽變異性哮喘等亞急性、慢性咳嗽開發的獨家產品，西醫《咳嗽的診斷與治療指南》（2021 版）[2]唯一推薦中成藥。該藥功效為疏風宣肺，止咳利咽，由九味中藥材組成，采用中藥提取與制劑工藝，對紫蘇葉、前胡提取揮發油，麻黃、五味子采用乙醇提取有效成分，地龍等五味藥材水提醇沉，制得浸膏減壓干燥后得到干膏粉，與揮發油包合物、藥用輔料混合制粒，整粒灌裝后最終得到蘇黃止咳膠囊。其中，地龍等五味藥材水提醇沉，制得浸膏減壓干燥后得到的干膏粉，因其富含多糖，具有很強的引濕性，直接影響制劑產品的質量，是中藥硬膠囊劑普遍存在的頑疾[2-3]。為此，有必要建立提取物中多糖含量的檢測方法，以增加制劑工藝過程控制，提升產品質量。本研究主要對蘇黃止咳膠囊提取物中多糖的含量測定條件進行研究。通過查閱文獻[3-5]，選用最常用的苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法進行方法開發，以D-無水葡萄糖為對照，采用紫外分光光度法，建立提取物中多糖的含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 儀器與試劑 UV-2550 型紫外分光光度計（島津公司）；XPE105 型電子天平（梅特勒-托利多）；HHS-21-8 型水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）。

蘇黃止咳膠囊（國藥準字Z20103075，規格：45 g，生產單位：北京海燕藥業有限公司）提取物由北京海燕藥業有限公司自制；無水乙醇、濃硫酸、苯酚、蒽酮等均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供；D-無水葡萄糖，由中國食品藥品檢定研究院提供，純度99.8%。

1.1.2 供試液的配制 精密稱取蘇黃止咳膠囊提取物，研細混勻，取約10 mg，至100 mL 容量瓶中，加入70.0%乙醇溶液定容至刻度，搖勻。精密量取5 mL，至200 mL 容量瓶中，純化水定容至刻度，搖勻，即得。

1.1.3 對照品溶液的配制 精密稱取D-無水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，純化水定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液儲備液。

1.2 方法

多糖的含量測定方法主要分兩大類：一類是利用組成多糖的單糖縮合反應而建立的方法，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法；另一類是直接測定多糖，如氣相色譜法和高效液相色譜等。中藥材多糖種類繁多，分子量大，結構復雜，這給直接測定多糖增加了難度。

故采用多糖的單糖縮合反應建立蘇黃止咳膠囊提取物中多糖的測定方法，利用多糖在強酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質來測定，即苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，故苯酚-硫酸法在紫外490 nm 處有最大吸收，蒽酮-硫酸法在紫外620 nm 處有最大吸收[6-8]。

1.2.1 苯酚-硫酸法顯色及測定條件的選擇

1.2.1.1 濃硫酸加入量考察 量取供試液2 mL 至試管中，加入4% 苯酚溶液1 mL，選擇加入濃硫酸體積5、7、9 mL，各制備5 份樣品，搖勻，至100℃水浴中加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。取適量倒入比色皿中，于490 nm波長下測定樣品溶液中多糖的吸光度。結果顯示，反應后樣品溶液的吸光度RSD 值分別為3.1%、2.1%、4.8%，優選濃硫酸加入體積為7 mL。

1.2.1.2 冰浴時間考察 量取供試液2 mL 至試管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至100℃水浴中加熱30 min，選擇不同的冰浴時間3、5、10 min 后，冷卻至室溫。取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長下測定樣品溶液中多糖的吸光度。結果顯示，反應后樣品溶液的吸光度RSD 值分別為1.36%、0.89%、1.65%，故冰浴時間確定為5 min。

1.2.1.3 水浴溫度的考察 量取供試液2 mL 至試管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至水浴中加熱，分別設置水浴溫度40、80、100℃，時間30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長下測定樣品溶液中多糖的吸光度，考察15 min 內樣品的穩定性。結果顯示，水浴溫度為100℃時，反應后樣品溶液的吸光度RSD 值分別為2.1%、0.158%、0.155%，故水浴溫度確定為100℃。

1.2.1.4 確定最佳顯色條件 量取供試液2 mL 至試管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至水浴溫度100℃條件下加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。在15 min 內，取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長下測定樣品溶液中多糖的吸光度。

1.2.1.5 D-無水葡萄糖標準曲線的制作 精密稱取D-無水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，加純化水定容至刻度，搖勻，作為儲備液。量取儲備液1、2、3、4、5 分別至50 mL 容量瓶中，用純化水定容至刻度即得5 個不同濃度的D-無水葡萄糖標準溶液。然后分別吸取2 mL D-無水葡萄糖標準溶液至試管中，加入4% 苯酚溶液1 mL，加入7 mL 濃硫酸，搖勻，至100℃水浴中加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。另取純化水2 mL，操作同上，加苯酚硫酸進行顯色反應，作為空白對照。分別取適量倒入比色皿中，于 490 nm 處測定上述溶液吸光度值，以D-無水葡萄糖濃度為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標，繪制D-無水葡萄糖標準曲線，并得出D-無水葡萄糖標準曲線的回歸方程：y=0.1323x+0.1347，相關系數R2=0.9913，D-無水葡萄糖質量濃度在3.261～16.303 μg/mL 范圍內與吸光值之間呈良好的線性關系，符合郎伯-比爾定律。

1.2.2 蒽酮-硫酸法顯色及測定條件的選擇

1.2.2.1 蒽酮-硫酸溶液用量的確定 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4、5 和6 mL，各制備5 份樣品，搖勻，混勻后沸水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測定反應產物的吸光值。結果顯示，反應后溶液的吸光度RSD 值分別為3.1%、4.3%、4.8%，優選濃硫酸加入體積為4 mL。

1.2.2.2 水浴溫度的考察 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，混勻后分別置于80、90 和100℃水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測定反應產物的吸光值。結果顯示，反應后溶液的吸光度RSD 值分別為1.12%、0.56%、0.17%。即水浴溫度為100℃時，樣品吸光度RSD 值最小，優選水浴溫度100℃。

1.2.2.3 水浴時間的考察 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL 搖勻，混勻后在100℃的沸水浴中分別顯色10、15、20 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測定反應產物的吸光值。結果顯示，反應后溶液的吸光度RSD 值分別為3.10%、2.46%、5.07%，即水浴時間為15 min 時，樣品吸光度RSD 值最小，優選水浴時間為15 min。

1.2.2.4 確定最佳顯色條件 取供試品溶液2 mL，置于試管中，同時以2 mL 純化水作為空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，混勻后在100℃的沸水浴中顯色15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測定反應產物的吸光值。

1.2.3.5 D-無水葡萄糖標準曲線的制作 精密稱取D-無水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，加純化水定容至刻度，搖勻，作為儲備液。量取儲備液1、2、3、4、5 分別至50 mL 容量瓶中，用純化水定容至刻度，即得5 個不同濃度的D-無水葡萄糖標準溶液。然后分別吸取2 mL D-無水葡萄糖標準溶液至試管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，至100℃水浴中加熱15 min，迅速置于冰水中冷卻。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中。另取純化水2 mL，操作同上，作為空白對照。分別于620 nm 處測定上述溶液的吸光度值，以D-無水葡萄糖濃度為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標，繪制D-無水葡萄糖標準曲線，并得出標準曲線的回歸方程：y=0.0 487x-0.0 082,相關系數R2=0.9 897，D-無水葡萄糖質量濃度在4.127～18.219 μg/mL范圍內與吸光值之間呈良好的線性關系，符合郎伯—比爾定律。

2 結果

實驗數據顯示，線性方面，苯酚-硫酸法線性相關性優于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法的精密度更高，方法更可靠。測量準確度方面，蒽酮-硫酸法的檢測結果略高于苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法可能與供試品中非糖物質發生了縮合反應，影響了測量精度。為確保蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的穩定、可靠。最終選用苯酚-硫酸法作為蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的測定方法，并開展了重復性、精密度、穩定性的方法研究[9-11]。

2.1 重復性

取同一份供試品，按照1.1.2 項下供試液配制方法，平行制備6 份供試品溶液，按照1.2.1.4 項下的最佳顯色條件測定吸光值，6 份供試品溶液中多糖含量的RSD 為1.5%，小于2.0%的接受標準，說明苯酚-硫酸法測定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的方法重復性良好。

2.2 精密度試驗結果

取同一份供試品，按照1.1.2 項下的供試液配制方法，平行制備6 份供試品溶液，按照1.2.1.4 項下的最佳顯色條件測定吸光值，6 份供試品中多糖含量的RSD 為0.7%，小于2.0%的接收標準，說明儀器的精密度良好。

2.3 中間精密度試驗結果

取與精密度實驗相同的供試品，另一實驗員按照1.1.2 項下的供試液配制方法，平行制備6 份供試品溶液，按照1.2.1.4項下的最佳顯色條件測定吸光值。兩名實驗員12 份樣品中多糖含量的RSD 為1.7%，小于2.0%的接收標準，說明中間精密度良好。

2.4 穩定性試驗結果

按照1.1.2 項下的供試液配制方法，配制一份供試液，按照1.2.1.4 項下的最佳顯色條件，每隔10 min 測定一次供試液的吸光度，1 h 內連續檢測供試品溶液中多糖的含量，多糖含量的RSD 為0.3%，小于2.0% 的接受標準，說明苯酚-硫酸法測定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的方法穩定性良好。

試驗結果顯示，苯酚-硫酸法測定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的方法，精密度良好，重復性良好，方法的中間精密度良好，顯色反應后1 h 內穩定性良好。供試品溶液中多糖含量的RSD 小于2.0%。

3 討論

通過查閱文獻，發現苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法是常用測定多糖含量的方法，方法簡單、快速易推廣[12-14]。實驗時，苯酚-硫酸法基本不受檢測過程中可能存在的蛋白質影響，先加入苯酚試劑，再加入濃硫酸，濃硫酸的加入觸發反應進行，反應完成生成穩定的化合物，故精密度、準確度、反應穩定性較好。但由于分次加入試劑，可能加入一致性略有差異，重復性略有降低。蒽酮-硫酸法測出的是溶液中全部可溶性碳水化合物總量，回收率略高；此外，因為一次性加入蒽酮試劑，故反應起點準確，重復性較好。大量文獻顯示，針對不同的研究對象、實驗研究結果略有不同。

本研究以蘇黃止咳膠囊提取物多糖含量測定作為研究對像，分別采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法進行多糖含量檢測，得出了苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法的最佳顯色條件。苯酚-硫酸法測定蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量的最佳顯色條件為：移液管量取供試液2 mL 滴入試管中，加入4%的苯酚溶液1 mL，隨后加入7 mL 濃硫酸，充分搖勻，放置至100℃水浴中加熱30 min，冰浴5 min 后冷卻至室溫。待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，于490 nm 波長下測定樣品溶液的吸光度。蒽酮-硫酸法測定提取物中多糖含量的最佳顯色條件為：移液管量取供試品溶液2 mL 滴入試管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，搖勻，將混合溶液放置至100℃水浴中顯色15 min，然后將混合溶液迅速置于冰水中冷卻，待冷卻至室溫，取適量倒入比色皿中，在620 nm 處測定樣品溶液的吸光度[9-11]。

實驗結果顯示，苯酚-硫酸法制作的標準曲線線性關系較好[15]，檢測結果精密度高，方法準確度較好，控制硫酸加入量、反應環境等，可以實現方法的高重復性和穩定性。故苯酚-硫酸法可作為蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量測定的首選方法，方法穩定、可靠、簡單、易于操作。

本文建立的蘇黃止咳膠囊提取物中多糖含量測定方法，有效監控中藥提取物中多糖吸濕物質的含量，為蘇黃止咳膠囊提取物中間產品控制提供了監測方法和控制指標，有利于提升制劑產品質量，減少內容物吸濕性問題，減少膠囊殼易脆碎問題，提升產品顧客滿意度。為其他中藥提取物制定中間產品控制標準提供了手段和思路。