小紅參免疫作用及質量標志物預測分析

張 希，東方梓涵，李 江，戚琬若，劉 旭，鄒昱蕾，余曉玲*

(1.昆明市中醫醫院，云南 昆明 650500；2.吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春130118)

小紅參，又名滇紫參，別稱活血、小活血、小紅藥、紅根、小茜草、小舒筋、色子片等，為茜草科植物云南茜草[Rubiayunnanensis(Franch.) Diels]的干燥根及根莖，是云南、貴州少數民族特色藥用植物之一，彝醫稱其為“乃佐色”，意譯為“小紅藥”[1]。

小紅參具有活血通經、祛風除濕、鎮靜止痛等功效，常用于治療女性痛經閉經、產后瘀阻、黃褐斑、不孕癥，以及跌打勞傷、關節風濕疼痛、咳嗽氣喘、頭昏腦脹、胃脘痛、心煩失眠等[2]?，F代研究明確其藥理作用主要有抗心肌缺血、抗腫瘤、抗氧化、抑制NO、治療銀屑病、升白以及祛痰等[3]，臨床主要用于皮膚病、外科、心血管、腫瘤及呼吸系統疾病的治療。近幾年關于小紅參的臨床應用研究主要集中在抗癌、抗心肌缺血以及治療銀屑病等方面。另外，通過查閱文獻，發現活血化瘀類中藥除了具有較強的抗凝血作用外，還有免疫炎癥調節作用，因此本研究以活血化瘀藥小紅參的主要臨床藥理作用為研究基礎，總結其在免疫調節方面的作用機制，為小紅參多靶點藥理作用的機制研究提供參考依據。

對中藥進行質量控制是臨床安全用藥的基本保證，目前對于中藥質量的分析大多參考藥物中單個或多個成分的含量作為質量控制依據，而該成分的選擇可能是因為易分離、易指認或含量較大等原因，因此存在藥效關聯度差、有效成分物質基礎不明確以及缺少特定有效成分對藥材整體把控等情況。因此，劉昌孝院士提出的中藥質量標志物概念，認為質量標志物是中藥材和中藥產品(包括中藥飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑)中固有的或加工制備過程中形成的，與中藥功能密切相關的化學物質[4]，這些化學物質對于中藥質量控制有重要作用[5]。本研究從傳統藥效、新藥效、成分特有性及成分可測性4個方面，對小紅參質量標志物(Q-marker)的成分進行分析，現報道如下。

1 小紅參的免疫作用

1.1 治療銀屑病的免疫機制

銀屑病是一種慢性易復發的炎癥性皮膚疾病，其具體發病機制目前仍處于研究中，但可明確的是銀屑病是由多基因改變引起的遺傳病，是一種以T淋巴細胞免疫介導為主、在多種免疫細胞共同作用下引起的角朊細胞異常增殖性皮膚病[6]。銀屑病皮損中先有CD4+T細胞等進入和活化，接著出現CD8+T細胞，當皮損消退時CD8+T細胞又逐漸增多，而皮損中CD4+T細胞減少或消失[7]。呂邵萍等[8]采用小紅參針劑對尋常型銀屑病患者進行治療，發現患者病情緩解后，外周血中CD3+、CD2+及CD4+數值均無明顯改變，而CD8+T細胞由治療前異常增高降到正常范圍，表明小紅參與了T細胞亞群的調節。

適量濃度的小紅參提取物有抑制經ConA誘導的T細胞增殖反應及其產生IL-2的能力，且隨著給藥劑量等增加，對其T細胞產生IL-2的抑制作用增強。但經LPS誘導的B細胞增殖反應無相同抑制效果；體外給藥小紅參蒽醌類及三萜類對外周血T淋巴細胞增殖反應均具有抑制作用，因此小紅參治療銀屑病的作用機制可能是通過蒽醌類及三帖類等免疫活性成分調節T淋巴細胞從而發揮作用[9-10]。

另有研究發現，急性銀屑病的誘發及其慢性持續存在的刺激因素都與鏈球菌感染有關。戴軍等[11]研究小紅參含藥血清干擾鏈球菌抗原刺激致敏小鼠的免疫細胞，發現其免疫藥理學結果提示小紅參含藥血清有抑制T淋巴細胞對鏈球菌超聲抗原的增殖作用，可抑制炎癥因子等釋放，并且其醇提取物含藥血清的抑制作用更明顯，抑制率高達26%。提示小紅參含藥血清可抑制T淋巴細胞增殖，且可能醇提取物中蒽醌含量較高，抑制效果更好；表明小紅參可能從細胞和分子水平抑制免疫炎癥反應，從而調節銀屑病患者的免疫功能異常。

1.2 抑制NO的免疫機制

一氧化氮(NO)作為信使因子和效應因子，在炎癥反應和免疫調節中發揮著重要作用。適量NO可在早期固有免疫應答中直接或間接抑制和殺傷病原微生物[12]，但過量的NO易形成炎癥級聯動反應，促使炎癥發展，導致機體異常[13]。

研究發現，銀屑病患者血漿中和皮損處NO含量明顯高于正常值，過量的NO會導致血管擴張和炎癥因子的釋放，且銀屑病皮損處的炎癥細胞表達iNOS增加，可進一步催化NO生成。顧錦章等[14]對SLE、接觸性皮炎、濕疹及銀屑病患者血清NO進行檢測，發現與正常對照組相比，銀屑病患者NO水平明顯升高，而經藥物干預后下降，表明銀屑病的形成機制可能與NO參與炎癥介質和免疫調節分子相關。

據報道，小紅參含藥血清對鏈球菌抗原誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的NO分泌有抑制作用。MORIKAWA T等[15]發現小紅參中紅蕓香醇C、紅蕓香醇A和F、紅蕓香酮C、2-甲基1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌能抑制NO的產生；小紅參根的水-丙酮提取物、乙酸乙酯溶解部分及其從中得到的rubianols-d與rubianols-e的化合物均能抑制脂多糖活化巨噬細胞中的NO。TAO J等[16]實驗結果也顯示了小紅參能抑制脂多糖活化的巨噬細胞中NO的分泌，同時能抑制誘導型一氧化氮合酶的誘導。FAN JT等[17-18]研究了小紅參中的茜草素和兩個新的環六肽，發現其能抑制脂多糖及干擾素-γ誘導的鼠巨噬細胞中NO的產生。據報道，喬木烷型三萜類化合物能夠抑制血小板聚集和NO的產生[19]，而從小紅參中分離出的主要三萜類成分茜草喬木醇G(RG)也屬于喬木烷型[20]，表明小紅參可能通過抑制NO的分泌及iNOS的誘導從而緩解皮損癥狀，以調節炎癥局部的免疫狀態，在細胞和分子水平抑制免疫炎癥反應。

然而，到目前為止，關于小紅參通過抑制NO來調節T細胞的功能及其亞群提高免疫功能的相關研究報道較少，其作用機理及信號通路尚不明確。因此將小紅參作為NO、iNOS的抑制劑，研究新的抗炎免疫的治療途徑，具有重要的醫療價值。

1.3 炎癥免疫調節機制

小紅參具有活血化瘀、養血生新的功效，近幾年研究發現小紅參在抗心肌缺血(再灌注損傷)、抗癌及抗氧化方面具有良好療效。

現代研究表明，在缺血性心臟病的發展過程中天然免疫應答具有關鍵性作用。TLRs被缺血性再灌注損傷的心臟組織激活后產生免疫應答，其主要機制是促進NF-κB活化及炎性因子的產生[21]。NF-κB是介導炎癥反應的關鍵轉錄因子，也被研究證實與多種炎癥性、自身免疫性、腫瘤性疾病的易感性有關[22]。FAN JT等[18]研究發現小紅參中rubiyunnanin D、RA-I、RA-V、RA-XXIV、RY-I能顯著抑制HEK-293-NF-κB 熒光素酶，穩定細胞中TNF-α誘導的NF-κB活化。ZENG等[20]研究小紅參中三萜類化合物茜草喬木醇G(RG)對TNF-α誘導的NF-κB信號傳導激活的影響，結果表明，RG可有效抑制NF-κB信號傳導激活。另外，小紅參中環肽類RA-V也能有效抑制NF-κB通路的激活，誘導癌細胞凋亡，抑制HUVEC和HMEC-1內皮細胞的血管生成[23]。

p65是NF-κB信號通路成分之一，已有研究證實，小紅參可通過阻礙NF-κB p65的磷酸化，進而抑制MI/R大鼠心肌細胞凋亡[24]。小紅參中三萜類化合物RG可通過下調NF-κB p65的表達，減弱NF-κB p65的轉位，從而抑制NF-κB信號通路的激活，進而調控下游p53、cyclin D1、Bcl-2和胱天冬酰胺酶，從而觸發HeLa細胞的凋亡和G0/G1阻滯。

Nrf2在細胞各種氧化應激損傷調節中具有重要作用，其在氧化應激作用下被激活，致使下游HO-1的表達，通過抗炎、抗氧化和調節細胞凋亡，對心血管疾病起到保護作用[25]。RA-XII為小紅參中分離得的一種天然環肽，XUSHENG AN等[26]研究發現RA-XII可通過阻斷Nrf2和HO-1調控的IκBa/NF-κB和MAPKs信號通路，抑制氧化應激和炎癥反應，延緩LPS誘導的炎癥模型小鼠死亡，并能增強腎組織切片中HO-1和Nrf2的表達。體外研究表明 Nrf2和HO-1抑制后，RA-XII的抗炎作用被部分逆轉。此外，RA-XII暴露可明顯降低促炎細胞因子的釋放，包括白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-8，并抑制IκB/NF-κB和MAPK等磷酸化。

通過對小紅參相關藥理活性機制的深入研究探討，發現小紅參的多種活性成分可通過調節NF-κB、TNF-α、HO-1、Nrf2、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8等靶點發揮其抗炎作用，而這些靶點在小紅參抗癌、抗氧化以及抗心肌缺血等藥理活性中發揮著重要作用，且這些靶點均為免疫炎癥調節中的重要靶點。表明小紅參可能參與了對免疫系統的修飾及對炎癥反應的調控，且可能發揮了重要作用。

2 小紅參質量標志物預測分析

本研究主要從傳統藥效、新的藥效、成分特有性及成分可測性4個方面對小紅參質量標志物(Q-marker)進行分析。

2.1 基于傳統藥效的質量標志物預測分析

小紅參功效主要在于活血祛瘀生新、通絡鎮靜止痛，可對應用于心血管、腫瘤、外科、婦科、皮膚科等方面的疾病。小紅參提取物Ⅱ-A可提高小鼠ATP含量及耐氧能力[27]，喬木烷型三萜類和游離蒽醌具有降血脂活性[28]，1，2-二羥基蒽醌和1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌可抗血小板聚集，茜草酮A與茜草醇A在低濃度時呈現出抗血小板聚集活性[29]，這與小紅參在治療心血管疾病與傳統藥效的活血祛瘀功效一致。小紅參醌、環已肽配糖體、RY-I及RY-I的苷元RA-V、RY-II具有抗癌活性[30-31]，MTA可誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡[32]，具有抗腫瘤活性。茜草喬木醇G(RG)對人類7種癌細胞系表現出強大的細胞毒性[33]。小紅參中的環己肽類化合物能抑制腹水癌(艾氏)、結腸癌、Lewis肺癌、實體癌、B-16黑色素瘤和白血病等[34]。FAN JT等[18]發現小紅參中的茜草素和環六肽均能抑制癌細胞毒性，RA-I、RA-V、RY-I、RY-II、RA-XXIV、rubiyunnanin B-H對11種癌細胞株呈現出細胞毒性，且rubiyunnanin B依賴于融合的絡氨酸殘基的糖基化而表現出顯著的抗癌譜，表明小紅參中蒽醌類、三萜類的茜草喬木酮、茜草喬木醇及環己肽類成分可作為傳統藥效的質量標志物成分。

2.2 基于新藥效的質量標志物預測分析

通過總結小紅參的藥理作用可知，其提取物Ⅱ-A可以升高白細胞[35]，小紅參醌具有抗氧化和抑制腸道細菌易位作用，茜草酮A(1)能抑制枯草芽孢桿菌活性[36]，紅蕓香醇C、紅蕓香醇A和F、紅蕓香酮 C和2-甲基1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌、喬木型三萜、茜草素及環肽類能抑制NO 的產生；蒽醌類提取物及三萜類可抑制T淋巴細胞增殖。2-甲基1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌對RBL-2H3細胞中β-己糖胺酶的釋放表現出抑制活性作用[16]，表明小紅參中這些化合物可作為新的藥效質量標志物成分。

2.3 基于成分特有性的質量標志物預測分析

一般來說，成分“特有性”體現在2個不同層次：①能代表和反映同一類藥材的共有性并區別于其他類藥材的特征性成分；②能反映同一類、不同種藥材之間的差異性成分，可分為種類和含量兩個層次[37]。但這只是表明了可測性，中藥本身是復雜的化合物組合，中藥本身的次生代謝產物和機體吸收過程中產生的內、外源性代謝產物也可作為成分“特有性”的指標之一，但目前關于其代謝產物鮮有報道。迄今報道的小紅參化學成分主要有蒽醌類、喬木烷型三萜類、環己肽類等，及少量香豆素、木脂素、芳香酸、甾體醇等成分類型[38]，其中小紅參醌、小紅參醌苷、小紅參醌丙等總蒽醌類為其特征性成分，但近幾年，有學者開始對其環肽類產生興趣，這可能會成為小紅參進一步開發的特有性成分之一。

2.4 基于成分可測性的質量標志物研究

關于小紅參的標準目前有《中國藥典》(1977年版一部)、《貴州省中藥材質量標準》(1988年版)、《云南省中藥材標準》(2005年版，第二冊彝族藥)、《湖南省中藥材標準》(2009年版，現行標準)?！吨袊幍洹纷?977年后的版本未對其收錄，近幾年地方標準也未有更新，現行標準也只對小紅參的基源、性狀、顯微、水分、灰分、酸灰及浸出物作了規定，但缺少關于其的定性和定量研究。李準[39]分別采用RP-HPLC和分光光度法測定小紅參醌苷和小紅參總蒽醌的含量，并通過分離鑒定出化合物1-羥基-4-O-β-D-葡萄糖萘酚苷，其余關于小紅參標準指紋圖譜及其特征性成分的檢測未見相關研究報道。因此，為了民族藥小紅參更好的挖掘利用，需要對其質量標準及其代表的指標性成分進行深入研究。

3 結語

近年來，越來越多的研究報道提示中藥及中成藥在免疫調節及抗炎方面具有較好的療效，并且認為活血化瘀類中藥在防治心血管疾病的過程中，除了有抗凝血作用外，還可能參與了免疫系統的修飾及對炎癥反應的調控。小紅參作為活血化瘀類民族藥目前已用于抗腫瘤、抗心肌缺血、抗氧化、治療銀屑病等多種方面，但通過對小紅參治療病癥相關機制的深入研究，發現其可能通過調節相關炎癥介導因子，抑制多個活性靶點來終止和緩解炎癥反應，從而達到治療效果?？傮w而言，小紅參在治療疾病方面運用廣泛，涵蓋了外科、婦科、呼吸系統、循環系統等，但是關于其相關治療機制及其藥效物質基礎尚不太明確，更多局限于某一類或某一部位成分，缺少“譜-效-量”之間的相關性研究。

本研究還對小紅參的質量標志物進行了預測分析，發現小紅參的主要活性成分包括小紅參醌、2-甲基-1，3，6-三羥基-9，10-蒽醌、茜草喬木醇G、茜草喬木酮(a、b、乙、丙等)及環肽類等，由于小紅參本身成分復雜且有效物質含量較少，沒有特定明確的物質基礎成分，并且小紅參的質量標準不統一，缺少與現代技術接軌的相關分析研究，更多局限于簡單的基礎鑒定；另外，小紅參本身的生長范圍有限，大多集中在西南、西部一帶，這也為藥材標準的建立增加了難度。因此，為了進一步明確小紅參的質量標志物成分，需要對小紅參的化學成分做進一步研究。

近幾年，民族藥的臨床應用研究逐漸增加，其功效被逐漸發掘，其藥用范圍也逐漸擴大。小紅參作為活血化瘀藥的免疫調節作用機制目前仍處于初步研究階段，還有很大的探索開發空間，值得繼續深入研究。作為重要的云南民族藥用植物之一，小紅參不能局限于作為地方藥材使用，其傳統藥效和新藥效的挖掘利用都具有重要的研究價值和廣闊的應用前景。