Pim1調控巨噬細胞M1型極化介導血管內皮細胞炎癥在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化中的作用*

鐘耕瑞，付萌萌，王小波，王漢琴△

（1湖北醫藥學院基礎醫學院解剖學教研室，湖北 十堰 442000；2湖北醫藥學院附屬隨州醫院轉化醫學研究中心，湖北 隨州 441300）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種常見的血管慢性炎癥疾病，其發病機制與內皮細胞損傷和巨噬細胞的浸潤等因素有關［1-2］。研究表明，巨噬細胞作為斑塊中炎癥因子的主要來源，受不同環境因子刺激可分化為具有不同功能和細胞表面標記的亞型，主要為經典活化M1型和選擇活化M2型，其功能表型影響AS進展及轉歸，其中，M1型巨噬細胞通過產生和分泌促炎因子，與內皮細胞之間相互作用，損傷內皮引發或加重炎癥反應［3］。

Pim1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Pim家族成員［4］。研究表明，Pim1可通過磷酸化多種炎癥蛋白底物在炎癥信號轉導中起作用，參與多種炎癥性疾病的發生［5-6］。新近的研究發現，抑制Pim1可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的巨噬細胞上清液中炎癥細胞因子的產生［7-8］，但是，Pim1是否對巨噬細胞極化有調控作用？目前尚不清楚。

本研究用LPS誘導小鼠Raw264.7細胞建立M1型巨噬細胞模型，用其上清作為條件培養液孵育人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），體外模擬內皮細胞在AS中的炎癥環境。在動物水平，用ApoE-/-小鼠頸動脈局部結扎術建立小鼠頸動脈AS斑塊模型。檢測Pim1對M1巨噬細胞極化的調節，及對內皮細胞血管內皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）、細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）和血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）表達的影響。本研究通過體外和體內實驗，旨在觀察Pim1是否通過調節巨噬細胞M1型極化介導內皮炎癥反應，并初步探討Pim1在ApoE-/-小鼠AS發生中的作用，以期為AS發生機制研究提供參考。

材料和方法

1 細胞及試劑

小鼠來源的巨噬細胞Raw264.7購自中科院上海細胞所；Trizol和Lipofectamine?3000購于Invitrogen；K1621逆轉錄試劑盒購于Thermo；iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix購自Bio-Rad；M199和DMEM培養液購自Gibco；血清購自天杭生物科技公司；酸性成纖維細胞生長因子購自Sigma；LPS和SMI-4a購自上海陶術生物科技有限公司；VE-cadherin抗體購自Abcam；Pim1抗體購自Novus；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、ICAM1和VCAM1抗體購自Immunoway；β-tubulin抗體和辣根酶標記的羊抗兔、羊抗鼠Ⅱ抗購自武漢安特捷生物技術有限公司；ApoE-/-小鼠由湖北醫藥學院胚胎干細胞實驗室郭興榮教授課題組惠贈。

2 方法

2.1 HUVECs的培養及鑒定取新鮮臍帶（湖北醫藥學院附屬隨州醫院產科提供，標本采集經過患者家屬知情同意及醫院倫理委員會批準），37℃的PBS沖洗臍靜脈3次，0.125%胰酶注入臍靜脈消化內皮細胞10 min，含血清的M199終止消化離心重懸，接種到多聚賴氨酸包被的培養瓶中，加入內皮細胞培養液（500 mL的M199全細胞培養液中含有100 mmol/L HEPES、10 nmol/L胸苷、2 mmol/L谷氨酰胺、4 g/L酸性成纖維細胞生長因子、5 000 U/L肝素和100 mL血清），置于37℃、5% CO2培養箱中靜置12 h，待細胞完全貼壁后更換新的培養液；5～7 d細胞至融合狀態消化傳代，血管內皮標志物Ⅷ因子免疫熒光鑒定，取第3～5代細胞進行實驗。

2.2 小鼠頸動脈AS模型的建立SPF級6周齡雄性ApoE-/-小鼠27只，體質量（25±1）g，許可證號為SCXK（蘇）2016-0004，經湖北醫藥學院實驗動物委員會批準。參考文獻［9］行左側頸動脈（left carotid artery，LCA）部分結扎術建模。5%水合氯醛（50 mg/kg）麻醉小鼠，仰臥位固定于無菌操作臺，頸前正中線切開皮膚，小心分離其頸前腺體，左側下頜處鈍性分離頸動脈4分支，7-0絲線結扎左頸內、頸外和枕后動脈，只保留甲狀腺上動脈，縫合頸前腺體和皮膚，尾靜脈注射抗生素預防感染。建模成功后的小鼠隨機分為兩組，每組9只，SMI-4a干預組每周尾靜脈注射75 mg/kg的SMI-4a，模型（model）組每周尾靜脈注射等體積DMSO；兩組小鼠8周齡改高脂飲食飼養，2個月后小鼠安樂死，收獲左右側頸動脈，-80℃保存備用。

2.3 siRNA干擾實驗搜索GenBank中小鼠Pim1基因全長cDNA序列，委托廣州銳博生物科技有限公司設計合成特異性siPim1序列及陰性對照（negative control，siNC）RNA序列，Pim1正義鏈5′-GTGTCAGC ACCTTATTAAA-3′，反義鏈5′-TTTAATAAGGTGCTGACAC-3′。待6孔 板 中Raw264.7細 胞 融 合 度 達50%，更換為OptiMEM培養液，Lipofectamine?3000轉染siRNA，實驗操作按照說明書進行。

2.4 巨噬細胞分組與干預（1）M1型巨噬細胞的誘導極化：使用終濃度20 nmol/L的LPS誘導Raw264.7細胞，作用時間為24 h，使細胞向M1表型極化，為M1型巨噬細胞實驗（LPS）組；用DMSO孵育的Raw264.7細胞為M0巨噬細胞對照（control）組。（2）巨噬細胞干預實驗：用終濃度50 nmol/L的Pim1抑制劑SMI-4a孵育Raw264.7細胞后，再用LPS誘導24 h，為LPS+SMI-4a組；Raw264.7細胞轉染siPim1和siNC后，再用LPS誘導24 h，為LPS+siPim1組和LPS+siNC組。

2.5 巨噬細胞條件培養液（conditioned medium，CM）的制備M1型、M0型、SMI-4a組、siNC組和siPim1組巨噬細胞經PBS洗2次，更換新的含10%血清的DMEM培養液繼續培養12 h，收集培養液上清作為CM，即CMM1、CMM0、CMSMI-4a、CMsiNC和CMsiPim1，用于孵育HUVECs。

2.6 油紅O染色左右頸動脈組織或者冰凍切片4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗兩次，60%異丙醇分化90 s，油紅O染色20～60 min，60%異丙醇洗掉背景色，拍照記錄。

2.7 免疫熒光染色-80℃取出實驗組和對照組小鼠頸動脈，冰凍切片，-20℃保存；HUVECs消化重懸接種于多聚賴氨酸包備的玻片，加入CM孵育24 h，吸干培養液，PBS洗2次。切片或細胞爬片4%多聚甲醛固定20 min，0.3% Triton X-100通透10 min，使用免疫組化筆畫圈，5%牛血清白蛋白37℃封閉30 min。Ⅰ抗（1∶100）37℃孵育90 min，熒光Ⅱ抗（1∶250）孵育30 min，DAPI染色15 s，滴加抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察采集圖像。

2.8 Western blot實驗用含有蛋白酶抑制劑的全細胞裂解液裂解細胞，血管組織從-80℃冰箱取出用液氮研磨后加入全細胞裂解液，5 000×g離心，蛋白定量后加入5×上樣緩沖液，100℃煮10 min。取5 μg蛋白經12% SDS-PAGE分離后，濕轉至PVDF膜（300 mA、100 min），5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，Ⅰ抗（1∶1 000）4℃搖床過夜，用辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，ECL顯色后采用ChemiDocTMXRS成像系統（Bio-Rad）成像，Image Lab凝膠分析軟件分析。

3 統計學處理

應用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。數據均為至少3次獨立重復實驗結果，以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用Student′st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LPS上調Raw264.7巨噬細胞iNOS和Pim1表達

Western blot結果顯示，與對照組相比，LPS（20 nmol/L）干預Raw264.7細胞24 h后，M1型巨噬細胞標志物iNOS表達顯著增多（P＜0.01），Pim1表達也顯著增多（P＜0.05），見圖1。

2 抑制或敲減Pim1對LPS誘導的巨噬細胞向M1型極化的影響

用不同濃度（0、10、20、30、50和100 nmol/L）的Pim1抑制劑SMI-4a孵育Raw264.7細胞，結果顯示，50和100 nmol/L的SMI-4a均可顯著抑制Pim1蛋白表達（P＜0.05），見圖2A。因此后續實驗選擇用SMI-4a濃度為50 nmol/L。Western blot結果顯示，與LPS組比較，用SMI-4a預處理Raw264.7細胞，再經LPS誘導，Raw264.7細胞中Pim1表達和M1型巨噬細胞標志物iNOS表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖2B。轉染siPim1和siNC后，與LPS+siNC組比較，LPS+siPim1組在抑制Pim1表達同時，M1型巨噬細胞標志物iNOS表達也顯著下調（P＜0.05），見圖2C。

Figure 1.LPS induced M1 macrophage polarization and increased Pim1 expression.Raw264.7 cells were incubated with LPS for 24 h.The protein levels of iNOS and Pim1 in Raw264.7 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 LPS誘導巨噬細胞向M1型極化及上調Pim1表達

Figure2.Pim1 inhibitor SMI-4a or knockdown of Pim1 attenuated LPS-induced polarization of macrophages to M1 phenotype.A：Raw264.7 cells were incubated with Pim1 inhibitor SMI-4a at the concentration range of 0～100 nmol/L，and Pim1 expression was detected by Western blot；B and C：Raw264.7 cells were treated with 50 nmol/L SMI-4a（B）or siPim1 transfection（C）followed by LPS induction for 24 h，and the protein levels of iNOS and Pim1 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.△P＜0.05 vs 0 nmol/L；*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group；&P＜0.05 vs LPS+siNC group.圖2 SMI-4a和敲減Pim1抑制了LPS誘導的巨噬細胞向M1型極化

3 M1型 巨噬 細 胞CM上調HUVEC中VCAM1和ICAM1的表達

免疫熒光結果（圖3A）可見，與CMM0組相比，用CMM1孵育HUVECs 24 h，CMM1組ICAM1和VCAM1的紅色熒光強度增強；Western blot結果（圖3B）顯示，CMM1顯 著 上 調 了HUVECs中ICAM1（P＜0.01）和VCAM1（P＜0.05）蛋白表達。

Figure 3.Conditioned medium（CM）of M1 macrophages up-regulated ICAM1 and VCAM1 expression in HUVECs.The HUVECs were incubated with M0 and M1 macrophage CM（CMM0 and CMM1）for 24 h.A：immunofluorescence image of HUVECs（blue is the nucleus，and red is ICAM1 and VCAM1；scale bar=50 μm）；B：the protein levels of ICAM1 and VCAM1 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CMM0 group.圖3 M1型巨噬細胞CM上調內皮細胞VCAM1和ICAM1表達

4 抑制或敲減Pim1對CMM1誘導的內皮細胞VCAM1和ICAM1表達的影響

免疫熒光結果（圖4A）可見，CMSMI-4a和CMsiPim1組HUVECs中ICAM1和VCAM1熒光強度顯著減弱。與免疫熒光結果一致，Western blot結果（圖4B、C）顯示，CMSMI-4a和CMsiPim1顯著下 調了HUVECs的ICAM1和VCAM1蛋白表達（P＜0.01）。

5 ApoE-/-小鼠頸動脈結扎后Pim1、iNOS、VE-cadherin、VCAM1和ICAM1的表達變化

Figure 4.SMI-4a or knockdown of Pim1 inhibited M1 macrophage conditioned medium（CM）-induced expression of VCAM1 and ICAM1 in HUVECs.The Raw264.7 cells were treated with SMI-4a or siPim1 transfection，and then the CM of each group was used to incubate HUVECs for 24 h.A：immunofluorescence image of HUVECs（blue is the nucleus，and red is ICAM1 or VCAM1；scale bar=50 μm）；B and C：the protein levels of ICAM1 and VCAM1 in HUVECs were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs CMM1 group；##P＜0.01 vs CMsiNC group.圖4 SMI-4a和敲減Pim1抑制了M1型巨噬細胞CM誘導的內皮細胞VCAM1和ICAM1表達

如圖5A，結扎小鼠左頸內、頸外和枕后動脈建立AS模型，選取模型組ApoE-/-小鼠兩側頸動脈，血管壁油紅O染色結果顯示，左側頸動脈（LCA）較右側頸動脈（RCA）脂質顯著蓄積，右側未結扎側無AS病變，而左側結扎側有明顯的AS病變。免疫熒光染色（圖5B）可觀察到，與未結扎側比較，結扎側血管壁M1型巨噬細胞標志分子iNOS紅色熒光亮度顯著增強，而血管內皮標志分子VE-cadherin綠色熒光強度減弱。Western blot結果（圖5C）顯示，結扎側血管壁Pim1、iNOS、ICAM1和VCAM1蛋白水平均顯著高于未結扎側（P＜0.05或P＜0.01），而VE-cadherin表達則顯著低于未結扎測（P＜0.05）。

6 SMI-4a對ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊及M1型巨噬細胞極化和黏附分子表達的影響

Figure 5.The expression of Pim1，iNOS，VE-cadherin，VCAM1 and ICAM1 in the carotid artery of ApoE-/-mice.A：the diagram of AS model constructed by carotid artery partial ligation in ApoE-/-mice（left），and the AS plaques in the carotid artery detected by oil red O staining（right）；B：immunofluorescence staining of VE-cadherin（green）and iNOS（red）in the carotid artery（blue is the nucleus；scale bar=100 μm）；C：Western blot was used to detect the protein levels of iNOS，VE-cadherin，Pim1，ICAM1 and VCAM1 in the carotid artery.Mean±SD.n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs RCA group.圖5 ApoE-/-小鼠AS模型頸動脈Pim1、iNOS、VE-cadherin、VCAM1和ICAM1的表達變化

建模后用SMI-4a干預，油紅O染色可見，SMI-4a組LCA脂質沉積明顯被抑制（圖6A），斑塊面積顯著減小（圖6B）。免疫熒光結果顯示，與模型組相比，SMI-4a組iNOS紅色熒光明顯減弱，VE-cadherin綠色熒光增強（圖6C）。Western blot結果（圖6D）顯示，SMI-4a組血管壁Pim1、iNOS、ICAM1和VCAM1蛋白表達均顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），而VEcadherin表達則顯著高于模型組（P＜0.05）。

討 論

AS特征是斑塊形成，也是缺血性心臟病和外周動脈疾病等多種疾病的病理基礎。有多種細胞參與AS進展，斑塊中巨噬細胞的主要來源是外周血單核細胞，巨噬細胞極化后釋放的炎癥因子可能是導致血管內皮損傷、加快AS進展的重要原因［1］。本研究結果可見，AS進展中，M1型巨噬細胞極化增多，伴隨Pim1表達顯著上調，內皮細胞黏附分子ICAM1和VCAM1的表達升高。

我們課題組前期研究觀察到，體外給予內皮細胞切應力刺激，與靜止組相比，15 dyn/cm2層流切應力可以顯著增加內皮細胞Pim1蛋白水平，促進內皮細胞一氧化氮生成［10］。本研究用小鼠頸動脈部分結扎建立的是低切應力斑塊模型［9］，即未行結扎側（右側頸動脈）為層流切應力，結扎側左側頸動脈為低切應力，結果顯示低切應力側血管壁中有斑塊形成同時Pim1蛋白水平的異常升高，與體外結果比較，我們推測在斑塊中可能還有其他細胞的Pim1表達上調，才導致血管壁Pim1蛋白水平升高。因此我們用小鼠Raw264.7巨噬細胞進行體外實驗，檢測到Raw264.7細胞在LPS誘導下向M1型巨噬細胞極化增多，并伴隨Pim1表達上調，提示是否是Pim1調節了巨噬細胞M1型極化，進而在AS形成中發揮了作用？

Figure 6.Effects of SMI-4a on the expression of Pim1，VE-cadherin，iNOS，VCAM1 and ICAM1 in the carotid artery of ApoE-/-mice.SMI-4a was injected into the tail vein of AS model ApoE-/-mice.A：oil red O staining of mouse carotid artery；B：AS plaque detected by oil red O staining in left carotid artery at cross section（scale bar=100 μm）；C：immunofluorescence staining of VE-cadherin（green）and iNOS（red）in left carotid artery（scale bar=100 μm）；D：Western blot was used to detect the protein levels of iNOS，VE-cadherin，Pim1，ICAM1 and VCAM1 in left carotid artery.Mean±SD.n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖6 SMI-4a對ApoE-/-小鼠頸動脈Pim1、VE-cadherin、iNOS、VCAM1和ICAM1表達的影響

Pim1蛋白在結構上缺乏調節亞基，Pim1功能被認為與其表達量一致［11］。用LPS誘導的Raw264.7細胞上清液去孵育內皮細胞，觀察到內皮黏附分子ICAM1和VCAM1的表達升高，是不是巨噬細胞M1型極化促進了內皮炎癥反應？為了驗證我們的假設，用Pim1抑制劑SMI-4a和siPim1敲 減Raw264.7細胞Pim1，結果顯示，伴隨Pim1表達的降低，M1巨噬細胞標志物iNOS表達也下降，其上清誘導內皮細胞黏附分子的表達同時降低，說明Pim1調節了巨噬細胞M1型極化，抑制了內皮細胞炎癥反應。在動物實驗中，向ApoE-/-小鼠尾靜脈注射SMI-4a，Pim1在體內受到整體抑制之后，iNOS紅色熒光染色減少，內皮標志物的綠色熒光染色連續性增加，顯示內皮損傷減少。考慮到抑制Pim1并不是特異性抑制巨噬細胞Pim1表達，本實驗所用濃度SMI-4a在血液中有殺傷單核細胞的作用［12］，也就是說可能是通過減少單核細胞在內皮上的黏附數量，導致M1巨噬細胞數量的減少。體內、體外實驗，我們得出初步結論，Pim1參與巨噬細胞M1表型極化，M1型巨噬細胞可以誘導內皮細胞黏附分子的表達，造成內皮損傷。

研究表明，巨噬細胞M1型極化后釋放的IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎因子是重要的炎性外泌蛋白，是導致包括AS在內的等多種炎癥性疾病發生的因素［13-15］。本研究只觀察了Pim1可以調控M1型巨噬細胞的極化，未檢測上清中IL-6、IL-1β和TNF-α等的作用，雖然有文獻證實，抑制Pim1可以抑制LPS誘導的Raw264.7細胞上清液中炎癥因子的產生［7-8］。但Pim1是否通過調節這些炎癥因子表達，從而影響內皮細胞黏附分子的合成，以及哪些信號分子參與了這個過程，有待進一步探討。

綜上所述，Pim1參與AS進展中M1型巨噬細胞極化，M1型巨噬細胞高表達Pim1促進了內皮黏附分子ICAM1和VCAM1的表達。但是Pim1作為絲氨酸/蘇氨酸激酶，與M1巨噬細胞極化有關的NF-κB等信號之間的關系，還需要我們接下來進一步的探索。同時，在AS進展中我們采用高脂飲食飼養，實驗中也觀察到Pim1參與了脂代謝的過程，但是內皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞都參與了脂質代謝，Pim1在脂代謝中的作用我們也會在以后的研究中加以闡述。