ATF6/CHOP信號通路對減毒牛結核分枝桿菌感染的THP-1細胞焦亡的調控作用*

馬伯利，劉悅陽，聶雪伊，李夢媛，楊 易，徐金瑞

（寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏銀川750021）

結核病（tuberculosis）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的一種慢性呼吸道傳染病［1］，中國結核病患者數量排名位于全球前列，結核病和艾滋病雙重感染［2］和耐藥結核病［3］的出現是造成人類結核病死亡的重要原因，Mtb能夠在宿主體內進入潛伏狀態。巨噬細胞是阻止Mtb入侵肺正常細胞的首要宿主免疫細胞［4］。Mtb被巨噬細胞吞噬后，可以分泌毒力因子與膜上的絲氨酸蛋白酶阻止蛋白酶G結合，進而調控巨噬細胞焦亡（pyroptosis），逃逸固有免疫的清除。Mtb分泌的EST12（12 kD early secreted antigen target）蛋白可激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）-caspase-1/11-消皮素D（gasdermin D，GSDMD）-白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）介導巨噬細胞焦亡［5］；Mtb早期分泌性靶抗原分泌系統1分泌的ESAT-6等蛋白導致宿主細胞質膜損傷，促進K+外流，進而釋放IL-1β和IL-18等炎癥因子并引發細胞焦亡［6］。牛型結核分枝桿菌減毒株（即卡介苗，Bacillus Calmette-Guérin，BCG）感染巨噬細胞可以誘導NLRP3炎癥小體表達及IL-1β和IL-18釋放［7］，且NLRP3炎癥小體、IL-1β和IL-18與巨噬細胞焦亡有密切關系［8］。

已有研究表明，內質網應激對BCG誘導巨噬細胞焦亡具有重要的調控作用，但是內質網應激3條通路——蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase Rlike endoplasmic reticulum kinase，PERK）、肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）和轉錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）［9］各自在BCG誘導巨噬細胞焦亡中發揮的作用尚未見報道。大量文獻研究顯示，ATF6通路在炎癥反應［10］、細胞凋亡［11］、自噬［12］及腫瘤細胞增殖［13］等方面具有重要調控作用。基于以上研究背景，本研究采用siRNA敲減ATF6和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）表達，經BCG感染THP-1細胞，采用Western blot檢測NLRP3炎癥小體相關蛋白、GSDMD的N端片段（N-terminal fragment of GSDMD，GSDMDN）、IL-1β p17及IL-18 p22蛋白的表達，采用CCK-8法檢測細胞活力，采用免疫熒光檢測GSDMD蛋白在細胞中的表達。本研究旨在揭示ATF6/CHOP信號通路在BCG誘導巨噬細胞焦亡中的作用，為深入研究內質網應激在結核分枝桿菌與宿主巨噬細胞互作中的調控作用提供參考資料。

材料和方法

1 細胞、試劑和儀器

人單核巨噬細胞THP-1購自中國科學院細胞庫；BCG購自成都生物制品研究所；RPMI-1640培養液和胎牛血清購自Gibco；佛波酯和Protease Inhibitor Cocktail購自Sigma-Aldrich；ATF6和CHOP干擾序列（表1）及GP-transfect-Mate購自上海吉瑪制藥有限公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術有限公司；蛋白提取試劑M-PER?購自Thermo Fisher Scientific；β-巰基乙醇購自北京索萊寶科技有限公司；兔源β-actin、CHOP和GSDMD多克隆抗體，FITC偶聯的羊抗兔IgG，熒光素偶聯的羊抗兔IgG購自Proteintech；兔源GSDMD、含caspase募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck

表1 siRNA所用引物信息Table 1.The primer information of siRNA

like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）、caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；兔源ATF6和cleaved caspase-1兔源多克隆抗體購自Affinity；CCK-8試劑盒購自北京愛必信生物科技有限公司。細胞計數儀購自Bio-Rad；光學顯微鏡購自Motic；Amersham?Imager 600自動化學發光成像儀購自GE；Enspire熒光酶標儀購自PerkinElmer；NanoDrop 8000和熒光共聚焦顯微鏡購自Thermo Fisher Scientific。

2 主要方法

2.1 細胞培養用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液于37℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，將處于對數生長期的THP-1細胞按照每孔1×106個接種于6孔板中，并加入50 μg/L佛波酯誘導THP-1細胞為巨噬細胞，用于后續實驗。

2.2 BCG培養配制含0.2% Tween-80的H7N9培養液，110℃、30 min高壓滅菌后，加入10%的ADC enrichment增菌劑。將BCG接種至7H9培養液中，在無菌細胞培養箱中繼續培養。BCG濃度通過Nano-Drop 8000測定600 nm的吸光度（absorbance，A）。BCG菌濃度計算方法：當A600=0.01時，表示BCG的菌濃度為1×1010L-1。

2.3 細胞轉染將對數生長期的THP-1細胞（1×106個）接種于6孔板中，細胞生長密度至80%～90%時，根據上海吉瑪制藥有限公司siRNA說明書分別轉染陰性對照si-NC、si-ATF6及si-CHOP。

2.4 BCG感染及分組設置si-NC組、si-NC+BCG組、si-ATF6+BCG組和si-CHOP+BCG組。si-NC組細胞轉染干擾si-NC 24 h后正常培養；si-NC+BCG組細胞用GP-transfect-Mate轉染試劑轉染si-NC 24 h后，以感染復數為10∶1的BCG感染24 h（感染復數的計算參照Zheng等［14］的方法）；si-ATF6+BCG組細胞用GP-transfect-Mate轉染試劑轉染si-ATF6 24 h后，以感染復數為10∶1的BCG感染24 h；si-CHOP+BCG組細胞用GP-transfect-Mate轉染試劑轉染si-CHOP 24 h后，以感染復數為10∶1的BCG感染24 h。BCG感染24 h后，提取細胞總蛋白進行Western blot實驗。

2.5 Western blot實驗使用含EDTA和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE分離，將蛋白轉印至PVDF膜上，用5%脫脂乳粉室溫封閉1 h，分別過夜孵 育β-actin（1∶3 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、pro-caspase-1（1∶1 000）、caspase-1 p20（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（1∶1 000）、ATF6（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000）和GSDMD（1∶1 000）蛋白抗體，用TBST洗滌6次，每次5 min，用熒光素偶聯的羊抗兔IgG（1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。用Amersham?Imager 600儀器對蛋白表達量進行檢測，使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算相關蛋白灰度值。

2.6 免疫熒光染色將按照2.1和2.3處理后的細胞使用PBS洗3遍，以4%多聚甲醛/PBS（pH 7.4）室溫固定20 min。0.1% Triton X-100通透20 min，5%驢血清蛋白封閉，抗GSDMD多克隆抗體（Proteintech，1∶250）孵育過夜。次日，37℃避光孵育FITC偶聯的熒光Ⅱ抗，DAPI染色，封片，用熒光共聚焦顯微鏡拍照。應用Image-Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件分析各實驗組的熒光圖片灰度值。

2.7 CCK-8法檢測細胞活力將THP-1細胞按照每孔104個接種至96孔板中，細胞培養液孔作為空白對照，每組樣本均設置3個復孔，按照2.1和2.3方法處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，室溫3 h后，按照說明書要求，使用酶標儀于450 nm處檢測細胞A值，建立標準曲線，計算細胞活力。實驗重復3次。

3 統計學處理

使用GraphPad Prism 9.0軟件處理數據。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BCG感 染THP-1細 胞 后GSDMD-N、cleaved ATF6及CHOP蛋白的表達

Western blot結果顯示，GSDMD-N、cleaved ATF6和CHOP蛋白的表達隨BCG感染時間的延長逐漸升高，GSDMD-N蛋白24 h達到最高，顯著高于0 h（P＜0.01），而CHOP和cleaved ATF6蛋白在48 h達到最高，顯著高于0 h（P＜0.01），見圖1。

2 敲減ATF6對BCG感染的THP-1細胞NLRP3炎癥小體活化的作用

Western blot結果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達顯著升高（P＜0.01）；與si-NC+BCG組相比，si-ATF6+BCG組cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達均顯著下調（P＜0.01），見圖2。

Figure 1.The protein levels of GSDMD-N，cleaved ATF6 and CHOP in THP-1 cells of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs 0 h.圖1各組細胞中GSDMD-N、cleaved ATF6及CHOP蛋白水平

Figure 2.The protein levels of cleaved ATF6，CHOP，NLRP3，ASC，pro-caspase-1，caspase-1 p20，IL-1β p17 and IL-18 p22 in THP-1 cells of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖2各組細胞中cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22蛋白的表達

3 敲減ATF6對BCG感染的THP-1細胞焦亡的作用

Western blot檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組GSDMD-N蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；敲 減ATF6后，si-ATF6+BCG組GSDMD-N蛋白表 達較si-NC+BCG組顯著下調（P＜0.01），見圖3A。CCK-8實驗結果表明，與si-NC組相比，si-NC+BCG組細胞活力顯著下調（P＜0.01）；敲減ATF6后，si-ATF6+BCG組細胞活力與si-NC+BCG組相比顯著上調（P＜0.01），見圖3B。免疫熒光染色結果顯示，si-NC+BCG組的GSDMD蛋白表達量顯著高于si-NC組（P＜0.01），si-ATF6+BCG組GSDMD蛋白表達量顯著低于si-NC+BCG組（P＜0.01），見圖3C。

Figure 3.Pyroptosis of THP-1 cells infected with BCG after knockdown of ATF6.A：GSDMD-N protein expression in THP-1 cells of each group；B：the cell viability was determined by the CCK-8 assay；C：immunofluorescence of GSDMD protein in THP-1 cells（scale bar=100 μm）.GSDMD was labeled by green fluorescent antibody；blue fluorescence labeled nuclei.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖3敲減ATF6后BCG感染的THP-1細胞的焦亡情況

4 敲減CHOP對BCG感染的THP-1細胞NLRP3炎癥小體活化的作用

Western blot結果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達顯著升高（P＜0.01）；與si-NC+BCG組 相 比，si-CHOP+BCG組CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22表達均顯著下調（P＜0.01），見圖4。

5 敲減CHOP對BCG感染的THP-1細胞焦亡的作用

Western blot結果顯示，與si-NC組相比，si-NC+BCG組GSDMD-N蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；敲減CHOP后，si-CHOP+BCG組GSDMD-N蛋白表達較si-NC+BCG組顯著下調（P＜0.01），見圖5A。CCK-8實驗結果表明，與si-NC組相比，si-NC+BCG組細胞活力顯著降低（P＜0.01）；敲減CHOP后，si-CHOP+BCG組細胞活力顯著高于si-NC+BCG組（P＜0.01），見圖5B。免疫熒光染色結果顯示，si-NC+BCG組的GSDMD蛋白表達量極顯著高于si-NC組（P＜0.01），si-CHOP+BCG組GSDMD蛋白表達量顯著低于si-NC+BCG組（P＜0.01），見圖5C。

討 論

Figure 4.The protein levels of CHOP，NLRP3，ASC，pro-caspase-1，caspase-1 p20，IL-1β p17，and IL-18 p22 in THP-1 cells of each group.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖4各組細胞中CHOP、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、IL-1β p17及IL-18 p22蛋白的表達

結核病是一種由Mtb引起的慢性傳染病，由于傳染范圍廣、感染人數多以及死亡病例多的原因，使得結核病成為一個全球性健康問題。當Mtb被肺泡巨噬細胞吞噬，巨噬細胞通過清除細菌和調節炎癥反應阻止Mtb入侵巨噬細胞［4，15］。Mtb通過細胞表面Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）、核甘酸結合寡聚化結構域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）、C型凝集素受體（C-type lectin receptor，CLR）、甘露糖受體（mannose receptor）受體及信號通路調控巨噬細胞凋亡、自噬及焦亡發生［16-18］。Mtb與巨噬細胞作用機制復雜，闡明結核分枝桿菌與巨噬細胞相互作用機制對于治療結核病具有重要意義。

細胞焦亡是一種程序性細胞死亡方式［19］。當巨噬細胞內模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）受到Mtb刺激后，促進NLRP3炎癥小體的組裝，NLRP3炎癥小體進一步激活caspase-1，切割GSDMD，使其成為有成孔活性的GSDMD-N，并導致細胞膜穿孔，破壞細胞的完整性，引起細胞內滲透壓改變而最終腫脹、破裂［20］。有文獻報道，Mtb可通過激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號促進巨噬細胞促炎細胞因子的產生，以caspase-1/NLRP3/GSDMD依賴性方式誘導細胞焦亡［21-22］；Mtb通過激活IL-1β的釋放引發細胞焦亡，促進Mtb逃逸至鄰近細胞［23］。本研究中，Western blot結果顯示，BCG感染的THP-1細胞GSDMD-N蛋白表達水平隨感染時間逐漸上升，引起THP-1細胞焦亡，這與聶雪伊等［24］的研究結果一致，進一步證實Mtb感染可導致巨噬細胞發生焦亡。

Figure 5.Pyroptosis of THP-1 cells infected with BCG after knockdown of CHOP.A：GSDMD-N protein expression in THP-1 cells of each group；B：the cell viability was determined by the CCK-8 assay；C：immunofluorescence of GSDMD protein in THP-1 cells（scale bar=100 μm）.GSDMD was labeled by green fluorescent antibody；blue fluorescence labeled nuclei.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；##P＜0.01 vs si-NC+BCG group.圖5敲減CHOP經BCG感染的THP-1細胞焦亡檢測

當Mtb感染巨噬細胞時，巨噬細胞內環境穩態發生改變可擾亂內質網功能則引發內質網應激，內質網應激持續活化會引發炎癥和細胞凋亡［25］。Mtb感染巨噬細胞能引起內質網應激標志性分子CHOP、ATF3、磷酸化真核起始因子2α（phosphorylated eukaryotic initiation factor 2α，p-eIF2α）及p-IRE1α在巨噬細胞中表達升高［26］，進而激活細胞凋亡［27-28］。聶雪伊等研究表明，BCG感染可激活內質網應激并引起巨噬細胞焦亡［24］。Li等［29］的研究表明，抑制內質網應激減弱了Mtb感染誘導的巨噬細胞焦亡。盡管已有研究證實內質網應激在結核菌感染巨噬細胞焦亡中發揮調控作用，但內質網應激3條信號通路各自在Mtb感染巨噬細胞焦亡中發揮怎樣的作用尚未有文獻報道。本研究結果顯示，BCG感染引起巨噬細胞焦亡和ATF6/CHOP信號通路激活，而在敲減ATF6和CHOP后，BCG感染的THP-1細胞焦亡水平下降，表明ATF6/CHOP信號通路參與調控BCG感染的THP-1細胞焦亡。

綜上所述，本研究首次證實ATF6-CHOP信號通路可以介導BCG感染的THP-1細胞焦亡，進而發揮對炎癥反應的調控作用。本研究結果為結核病的發病機制研究提供了參考資料。