MLK3基因敲除抑制骨骼肌損傷后再生*

高詩(shī)娟，張燕紅，方光明，杜 杰

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029）

人體約80%的蛋白由骨骼肌儲(chǔ)存。骨骼肌萎縮不僅直接導(dǎo)致骨骼肌功能下降，還會(huì)導(dǎo)致全身營(yíng)養(yǎng)不良，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。骨骼肌在正常及病理狀況下處于損傷和再生的動(dòng)態(tài)過(guò)程。損傷和再生失衡會(huì)導(dǎo)致骨骼肌萎縮。骨骼肌再生由一群位于肌纖維基底膜和肌膜之間的肌衛(wèi)星細(xì)胞來(lái)完成。這群長(zhǎng)期處于相對(duì)靜息狀態(tài)的細(xì)胞在骨骼肌受到損傷刺激時(shí)被激活，繼而經(jīng)過(guò)增殖、分化、融合形成新的肌纖維，從而完成骨骼肌再生過(guò)程［1-2］。肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化受多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控。Notch信號(hào)通路的活化促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞自我更新，抑制分化［3］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的激活則促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化［4-5］。闡明肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于認(rèn)識(shí)如何維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)，阻止骨骼肌萎縮具有重要意義。

混合譜系激酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）是MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達(dá)于骨骼肌、肺、肝及心臟等組織。MLK3通過(guò)激活MAPK下游成員c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）及p38 MAPK等，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡［6］。MLK3基因敲除（MLK3gene knockout，MLK3KO）小鼠心臟功能下降，心臟纖維化加重［7-8］。但MLK3在骨骼肌損傷再生中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究在MLK3KO小鼠及野生型（wild-type，WT）小鼠中建立骨骼肌損傷再生模型，探討MLK3在骨骼肌再生中的作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

10～12周齡SPF級(jí)雄性C57BL6/J小鼠購(gòu)自北京唯尚立德公司，以C57BL6/J為背景的MLK3KO小鼠由上海邦耀公司協(xié)助構(gòu)建，均飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守本醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

2 主要試劑

蛇毒心臟毒素（cardiotoxin，CTX）購(gòu)自Merck；MLK3抗體（#4370S）、p-ERK1/2抗體（#4370）、ERK1/2抗體（#4695）、p-JNK抗體（#4668）、JNK抗體（#9252）、p-p38抗體（#4511）及p38抗體（#9212）均購(gòu)自Cell Signaling Technology；配對(duì)盒蛋白7（paired box protein 7，PAX7）抗體（AB_528428）購(gòu)自Developmental Studies Hybridoma Bank；麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）抗體購(gòu)自Sigma；Alexa Fluor 555和Alexa Fluor 488熒光Ⅱ抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch；總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）和T-PER組織蛋白提取液均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；SYBR Green Real-Time PCR試劑購(gòu)自TaKaRa；Masson染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

3 主要方法

3.1 骨骼肌損傷模型構(gòu)建10～12周齡的雄性WT及MLK3KO小鼠麻醉后，脛骨前肌注射CTX（10 μmol/L，30 μL）制備骨骼肌損傷模型［9］。

3.2 RNA提取及RT-qPCR使用TRIzol法提取成纖維細(xì)胞或小鼠脛骨前肌總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，步驟如下：RNA與Oligo dT混合后，65℃孵育5 min，加入逆轉(zhuǎn)錄酶及緩沖液，42℃60 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，70℃5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。得到的cDNA在iQ5系統(tǒng)（Bio-Rad）中使用SYBR試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參照，目標(biāo)基因表達(dá)水平以2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。MLK3的上游引物序列為5′-CCCTTTGCACAACTCATGGC-3′，下 游 引物 序列為5′-GAATGGAAGGAGTCCCGTGG-3′；Myog的上游引物序列為5′-CAGCCCAGCGAGGGAATTTA-3′，下游引物序列為5′-AGAAGCTCCTGAGTTTGCCC-3′；Myod的上游引物序列為5′-AGCATAGTGGAGCGCATCTC-3′，下游引物序列為5′-GGTCTGGGTTCCCTGTTCTG-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-AATGCATCCTGCACCACC-3′，下游引物序列為5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCG-3′。

3.3 Western blot實(shí) 驗(yàn)分離CTX處 理 的WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌，T-PER組織裂解液（補(bǔ)充0.5 mol/L EDTA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白后，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將總量為80 μg的蛋白經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入MLK3、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38、p38及GAPDH等抗體，4℃孵育過(guò)夜。加入Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用Odyssey紅外熒光掃描成像儀捕獲目的條帶。目的條帶定量分析采用ImageJ軟件。

3.4 免疫熒光染色收集CTX處理的WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌制備冰凍切片，用預(yù)冷的冰丙酮固定20 min，室溫晾干20 min后PBS洗，0.3%Triton X-100透化10 min，2次。3% BSA室溫封閉1 h，加入PAX7抗體，4℃過(guò)夜，PBS洗3次，加入Alexa Fluor 555熒光二抗，室溫孵育40 min，PBS洗后，DAPI封片。使用Leica ST5激光掃描共聚焦顯微鏡觀察PAX7的熒光強(qiáng)度。

3.5 WGA染色收集CTX處理的WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌制備石蠟切片（4 μm），經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水后，抗原熱修復(fù)，羊血清工作液室溫封閉30 min，滴加1∶100稀釋的WGA抗體，37℃避光孵育1 h，PBS洗后，DAPI封片液封片。倒置熒光電子顯微鏡（Nikon）采集圖像，NIS Br 3.0軟件計(jì)算肌纖維橫截面積，每張切片統(tǒng)計(jì)200個(gè)肌纖維。

3.6 Masson膠原纖維染色將WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌石蠟切片脫蠟至水。使用Masson染色液染色，基本步驟如下：鐵蘇木素染色5～10 min，酸性乙醇分化5～15 s；Masson藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min；麗春紅品紅染色5～10 min；磷鉬酸溶液洗1～2 min；苯胺藍(lán)染色1～2 min；乙醇脫水、中性樹(shù)膠封片。倒置電子顯微鏡（Nikon）采集圖像，膠原纖維呈藍(lán)色，骨骼肌細(xì)胞呈紅色。NIS Br 3.0軟件計(jì)算纖維化面積。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨骼肌損傷后早期MLK3表達(dá)水平顯著升高

為探討MLK3是否參與骨骼肌損傷后修復(fù)，收集CTX處理0、1、3和5 d的小鼠脛骨前肌，RT-qPCR檢測(cè)MLK3的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)CTX處理后3 d骨骼肌中MLK3的mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖1A；Western blot結(jié)果顯示，CTX處理后3 d的骨骼肌中MLK3蛋白表達(dá)升高，見(jiàn)圖1B。這提示MLK3可能在骨骼肌損傷后再生過(guò)程中發(fā)揮作用。

Figure 1.Mixed lineage kinase 3（MLK3）was up-regulated in regenerating tibial anterior（TA）muscles at early stage after cardiotoxin（CTX）-induced injury.A：MLK3 mRNA levels in TA muscles from wild-type mice at indicated time points after CTX injury（n=6）；B：MLK3 protein expression in regenerating TA muscles at 3 d after injury（n=3）.Mean±SD.**P＜0.01 vs 0 d.圖1 MLK3在骨骼肌損傷修復(fù)早期表達(dá)升高

2 MLK3缺失導(dǎo)致骨骼肌損傷后再生能力下降

為探討MLK3是否在骨骼肌再生過(guò)程發(fā)揮作用，我 們 構(gòu) 建 了MLK3KO小鼠，Western blot驗(yàn)證MLK3KO小鼠骨骼肌纖維中無(wú)MLK3蛋白表達(dá)（圖2A）。進(jìn)而，WT及MLK3KO小鼠給予CTX處理誘導(dǎo)損傷。損傷后7 d，收集WT及MLK3KO小鼠骨骼肌，WGA染色觀察新生肌纖維大小及排列。未受損的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌纖維排列緊密，肌纖維橫截面面積無(wú)差別；CTX誘導(dǎo)損傷7 d，MLK3KO小鼠骨骼肌纖維排列較對(duì)照組紊亂，新生的骨骼肌肌纖維橫截面面積顯著小于WT小鼠（P＜0.01），見(jiàn)圖2B。這表明MLK3KO小鼠骨骼肌再生能力下降。

3 MLK3基因缺失加重骨骼肌損傷后纖維化

WT及MLK3KO小鼠脛骨前肌給予CTX處理后7 d，受損部位骨骼肌Masson染色評(píng)價(jià)膠原沉積情況。未損傷時(shí)MLK3KO和WT小鼠膠原纖維陽(yáng)性面積無(wú)顯著差異。損傷后7 d，MLK3KO和WT小鼠藍(lán)色膠原纖維陽(yáng)性面積均增加，但MLK3KO小鼠膠原纖維陽(yáng)性面積顯著高于WT小鼠（P＜0.01），見(jiàn)圖3。這提示MLK3基因缺失加重骨骼肌損傷部位的纖維化。

4 MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化

免疫熒光檢測(cè)WT及MLK3KO小鼠損傷后3 d骨骼肌中PAX7陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示MLK3KO小鼠骨骼肌中PAX7陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于WT小鼠（P＜0.01），見(jiàn)圖4A。RT-qPCR檢測(cè)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化關(guān)鍵基因Myod和Myog的mRNA水平，結(jié)果顯示損傷后3 d的WT小鼠骨骼肌中Myod和Myog的表達(dá)較未損傷組顯著升高，但MLK3KO小鼠損傷后3 d的骨骼肌中Myod和Myog表達(dá)與WT小鼠相比均顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4B。上述結(jié)果表明MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化。

5 MLK3基因缺失抑制ERK1/2活化

Western blot檢 測(cè)CTX損 傷 后3 d的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌中ERK1/2、JNK及p38磷酸化水平，結(jié)果顯示MLK3KO小鼠骨骼肌中磷酸化ERK1/2的水平與WT小鼠相比顯著下降（P＜0.01），但磷酸化JNK及磷酸化p38的水平?jīng)]有顯著差異，見(jiàn)圖5。上述結(jié)果表明再生的骨骼肌中MLK3基因缺失抑制ERK1/2信號(hào)通路的激活。

Figure 2.MLK3 deficiency resulted in impaired regeneration in injured muscle.A：Western blot analysis of MLK3 protein levels in muscles isolated from WT and MLK3KO mice；B：the WT and MLK3KO muscles were immunostained with WGA（green）at 0 and 7 d after CTX-induced injury（scale bar=20 μm），and the myofiber mean cross-sectional area（CSA）was analyzed（n=6）.Mean±SD.**P＜0.01 vs WT.圖2 MLK3基因缺失鼠骨骼肌損傷后再生能力下降

Figure 3.MLK3 deficiency resulted in increased muscle fibrosis in injured muscle.Masson staining was performed to detect collagen deposition（blue）in TA muscles isolated from WT and MLK3KO mice（scale bar=20 μm），and the ratio of fibrosis area per filed was calculated.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs WT.圖3 MLK3基因缺失加重骨骼肌損傷后纖維化

討 論

骨骼肌損傷后，肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和分化對(duì)于骨骼肌再生、促進(jìn)損傷后修復(fù)，維持骨骼肌功能，阻止骨骼肌萎縮至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致骨骼肌損傷后再生能力下降，間質(zhì)纖維化加重，表明MLK3在骨骼肌再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

骨骼肌損傷后修復(fù)過(guò)程大致分為三個(gè)階段：炎癥期（數(shù)小時(shí)～7 d）；再生期（2～7 d），肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖、分化、融合形成新的肌纖維；重塑期（5～30 d），細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、新生肌纖維變大重塑等。其中，骨骼肌損傷后早期肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化對(duì)整個(gè)修復(fù)至關(guān)重要［10］。本研究發(fā)現(xiàn)CTX誘導(dǎo)損傷后早期（3 d）MLK3表達(dá)顯著升高，提示MLK3可能參與骨骼肌損傷后再生的早期細(xì)胞事件。

Figure 4.MLK3 deficiency impaired the proliferation and differentiation of muscle satellite cells.A：At 3 days after injury，PAX7 positive cells in WT and MLK3KO muscles were detected by immunofluorescence staining for PAX7（scale bar=20 μm），and percentages of PAX7 positive cells per field were analyzed（n=4）；B：the mRNA levels of Myod and Myog in WT and MLK3KO muscles at 0 and 3 d after injury were assessed by RT-qPCR（n=6）.Mean±SD.**P＜0.01 vs WT.圖4 MLK3基因缺失抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化

Figure 5.MLK3 deficiency inhibited phosphorylation of ERK1/2.Western blot analysis of the phosphorylation levels of ERK1/2，JNK and p38 in WT and MLK3KO muscles at 3 d after injury.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs WT.圖5 MLK3基因缺失抑制ERK1/2磷酸化

骨骼肌再生期肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖、分化、融合受到生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs；包括PAX7、MyoD、MyoG等）的序貫表達(dá)所嚴(yán)格調(diào)控。骨骼肌損傷后，靜息的PAX7陽(yáng)性肌衛(wèi)星細(xì)胞活化，轉(zhuǎn)化為PAX7陽(yáng)性、MyoD陽(yáng)性的肌母細(xì)胞，繼而分化成MyoG陽(yáng)性的肌細(xì)胞。單個(gè)核的肌細(xì)胞融合成多個(gè)核肌細(xì)胞，并與殘留受損的肌纖維融合，形成新的肌纖維，從而完成骨骼肌再生過(guò)程［11］。該過(guò)程受到細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)控。比如Notch信號(hào)激活通過(guò)抑制MyoD的表達(dá)而抑制分化［3］。MAPK信號(hào)通路在骨骼肌再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用：血管緊張素1結(jié)合Tie-2受體，激活下游ERK1/2，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化［4］。胰島素樣生長(zhǎng)因子激活p38，活化的p38介導(dǎo)再生關(guān)鍵因子MyoD的表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌再生［5］。MLK3作為MAPK級(jí)聯(lián)通路中ERK1/2及p38上游的關(guān)鍵激酶，其對(duì)ERK1/2及p38的激活是否在骨骼肌再生過(guò)程中發(fā)揮作用既往未見(jiàn)研究報(bào)道。

骨骼肌損傷后，位于肌纖維基底膜和肌膜之間的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化，形成新的肌纖維，從而完成骨骼肌再生。PAX7是肌衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)志物，并且在肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用［12］。本研究在損傷后3 d的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌中通過(guò)免疫熒光觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞PAX7陽(yáng)性細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)MLK3KO小鼠PAX7陽(yáng)性細(xì)胞比例下降。PAX7表達(dá)于靜息的肌衛(wèi)星細(xì)胞及由肌衛(wèi)星細(xì)胞分化而來(lái)的肌母細(xì)胞，PAX7陽(yáng)性細(xì)胞比例下降，提示肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化能力下降。損傷后3 d，MLK3KO小鼠骨骼肌中分化關(guān)鍵基因Myod和Myog的表達(dá)下降，進(jìn)一步證實(shí)了MLK3基因缺失導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化能力減弱。基于既往研究ERK1/2及p38活化促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化及MLK3對(duì)ERK1/2和p38的激活作用，我們推測(cè)MLK3可能通過(guò)活化ERK1/2或p38促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化。Western blot檢測(cè)CTX損傷后3 d的WT及MLK3KO小鼠骨骼肌中磷酸化ERK1/2和p38水平，顯示MLK3KO小鼠中磷酸化ERK1/2水平下降，而p38磷酸水平?jīng)]有變化，提示MLK3通過(guò)激活ERK1/2促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化。MLK3可以激酶依賴和激酶非依賴的方式激活ERK1/2［6，13］。在肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中，MLK3通過(guò)何種方式激活ERK1/2還有待探討。另外，骨骼肌損傷再生過(guò)程中，何種機(jī)制介導(dǎo)了MLK3的表達(dá)升高也不清楚，后續(xù)需要深入探討。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示蛋白激酶MLK3基因缺失通過(guò)抑制ERK1/2活化降低骨骼肌損傷后肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，并導(dǎo)致骨骼肌損傷后再生能力受損，表明MLK3通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路在骨骼肌再生中發(fā)揮重要作用，調(diào)控該信號(hào)通路可能有望成為骨骼肌萎縮的治療新方向。