白楊素對離體培養(yǎng)致炎大鼠軟骨細胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/PERK/CHOP通路的影響*

廖太陽，楊 楠，張 力，吳 鵬，王培民，丁 亮

［南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（江蘇省中醫(yī)院）骨傷科，江蘇 南京 210029］

軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細胞類型，在細胞外基質(zhì)的合成和更新過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并維持基質(zhì)的完整。研究表明，軟骨細胞凋亡可引起軟骨破壞，使得關(guān)節(jié)功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的發(fā)生［1］。因此，維持軟骨細胞的正常功能對保護關(guān)節(jié)軟骨健康具有重要意義。白楊素（chrysin，CHR）是一種具有多種藥理活性的黃酮類化合物，存在于許多植物中，如木蝴蝶和黃芩等，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等作用，同時對致炎軟骨細胞具有明顯的保護作用［2-4］。研究表明，CHR可通過抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB）活化及高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）信號通路緩解白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)的人OA軟骨細胞凋亡并抑制炎癥，促進軟骨細胞分泌II型膠原，維持軟骨的正常功能［4-5］。另一項研究顯示，CHR可抑制糖尿病中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）和氧化損傷［6］。然而，白楊素在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）中的軟骨保護機制，尤其是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/PERK/CHOP相關(guān)的信號通路，尚不十分清楚。本實驗以大鼠軟骨細胞作為研究對象，探討CHR抑制軟骨細胞凋亡的可能作用機制，為其治療骨關(guān)節(jié)炎提供部分細胞實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 動物

SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，8周齡，體重160～180 g，購自杭州醫(yī)學(xué)院，生產(chǎn)許可證號為SCXK（浙）2019-0002。于22～25℃，濕度55%～65%和晝夜更替時間12 h的條件下進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間大鼠正常自由攝水和飲食。

2 實驗材料

DMEM培養(yǎng)液購自Corning；胎牛血清和Ⅱ型膠原酶購自Gibco；青霉素-鏈霉素溶液、ECL和胰酶購自Biosharp；白楊素購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；脂多糖購自Sigma；甲苯胺藍染色液購自Leagene；蛋白酶和磷酸酶抑制劑和CCK-8購自APExBIO；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD Pharmingen；預(yù)制膠購自南京艾思易生物科技有限公司；Hoechst 33342染色液、DAPI、BCA蛋白檢測試劑盒和RIPA強裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗Ⅱ型膠原抗體及羊抗兔和羊抗小鼠Ⅱ抗購自Affinity；抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗cleaved caspase-3抗體、抗caspase-9抗體、抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein78，GRP78）抗體、抗轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor-6，ATF-6）抗體、抗CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）抗體和抗GAPDH抗體購自Proteintech；抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）抗體、抗p-PERK抗體、抗真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）抗體和抗p-eIF2α抗體購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

3 主要方法

3.1 大鼠原代軟骨細胞的分離培養(yǎng)SD大鼠按照文獻中的方法［7-8］，取膝關(guān)節(jié)脛骨平臺軟骨，置于含1%雙抗的PBS溶液內(nèi)，漂洗2次后，用剪刀清理軟骨周圍的肌肉等組織，再將軟骨在PBS溶液中剪碎至1 mm×1 mm×1 mm碎塊，加入適量的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃下消化4 h，用70目細胞濾網(wǎng)過濾，濾過液經(jīng)300×g離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，接種至10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃恒溫、5%CO2體積分數(shù)及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)24 h后換液，以后每2 d換液1次。鏡下觀察軟骨細胞生長情況，后續(xù)實驗所用為對數(shù)生長期的軟骨細胞。

3.2 甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定大鼠軟骨細胞甲苯胺藍染色：將對數(shù)生長期的大鼠軟骨細胞以每孔4×104接種于12孔板，培養(yǎng)36 h后，棄去培養(yǎng)液。每孔滴加4%多聚甲醛500 μL，室溫固定30 min。每孔滴加甲苯胺藍染色液500 μL，室溫染色5 min，滴加等量無菌的蒸餾水輕輕混勻，染色15 min；PBS洗滌細胞2次，每孔最后留1 mL PBS，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。Ⅱ型膠原免疫熒光染色：將對數(shù)生長期的軟骨細胞以每孔4×104接種于12孔板，培養(yǎng)36 h后，棄去培養(yǎng)液。每孔滴加4%多聚甲醛500 μL，室溫固定30 min。加入0.3%的Trition X-100透膜30 min，5%牛血清蛋白封閉1 h，Ⅱ型膠原抗體（1∶200）4℃孵育過夜。將羊抗兔Ⅱ抗（1∶1 000）避光孵育1 h，滴加適量DAPI孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察拍照。

3.3 CCK-8法檢測細胞活力將大鼠原代軟骨細胞接種至96孔板中（每孔1×104個），培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個復(fù)孔。待軟骨細胞貼壁且生長穩(wěn)定后，將軟骨細胞隨機分為對照（control）組、LPS組和CHR處理

組（處理濃度分別為1和5 mg/L）。LPS的實驗劑量和干預(yù)時間是參照國內(nèi)外文獻及結(jié)合筆者所在實驗室所培養(yǎng)細胞的具體情況進行前期條件摸索所得［9-11］。對照組加入含0.1%二甲基亞砜的培養(yǎng)液，其余3組加入含1 mg/L的LPS培養(yǎng)液處理細胞12 h，后CHR處理組分別加入含1和5 mg/L的CHR培養(yǎng)液。藥物處理24 h后，各孔加入10 μL的CCK-8試劑，孵育2 h，使用酶標儀檢測其在450 nm處吸光度（A）值。細胞相對活力（%）=實驗組A值/對照組A值×100%。

3.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況實驗人員根據(jù)試劑盒說明書嚴格操作。將大鼠軟骨細胞以每孔1×106接種于6孔板過夜培養(yǎng)，分組及給藥劑量參照方法3.3。藥物處理24 h后，PBS洗滌細胞2次，用不含EDTA的0.25%胰酶消化2 min、適當(dāng)吹打并收集各組細胞，300×g轉(zhuǎn)速下離心3 min，棄上清，加入500 μL的1×Binding Buffer懸浮細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，分別加5 μL Annxeni V-FITC和5 μL PI染色試劑，輕輕混勻后暗室孵育20 min。最后用500 μL PBS補足1 mL，輕輕混勻，流式細胞儀上機檢測。

3.5 Hoechst 33342染色法檢測凋亡細胞核形態(tài)Hoechst 33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低，廣泛使用于細胞凋亡檢測。當(dāng)細胞膜完整，熒光染料僅能少許進入正常細胞膜，此時正常細胞核呈現(xiàn)低強度藍色熒光，當(dāng)細胞出現(xiàn)凋亡，細胞膜通透性增強，熒光染料進入凋亡細胞比正常細胞增多，此時凋亡細胞核呈現(xiàn)高強度藍色熒光。將大鼠軟骨細胞以每孔4×105接種于12孔板過夜培養(yǎng)，分組及給藥劑量參照方法3.3。藥物處理24 h后，PBS洗滌細胞2次，每孔加入Hoechst 33342染色液600 μL，室溫避光染色15 min后，吸棄染色液，PBS洗滌細胞2 min，每孔加500 μL PBS。熒光顯微鏡下觀察各組細胞核的形態(tài)變化并拍照，應(yīng)用ImageJ軟件定量分析藍色熒光強度。

3.6 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達將大鼠軟骨細胞以每孔1×106接種于6孔板培養(yǎng)，分組及給藥劑量參照方法3.3。藥物處理24 h后，PBS洗滌細胞2次，細胞用混合液（VRIPA∶V蛋白酶和磷酸酶抑制劑=100∶1）4℃振蕩裂解30 min，提取細胞總蛋白并定量。取20 μg總蛋白在恒壓條件下完成SDS-PAGE，接著采用恒流濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，分別加入Ⅰ抗（抗Bax抗體，1∶5 000；抗Bcl-2、抗cleaved caspase-3抗體和抗CHOP抗體，1∶2 000；抗GRP78抗體，1∶3 000；抗caspase-9抗體、抗ATF-6抗體、抗PERK抗體、抗p-PERK抗體、抗eIF2α抗體和 抗p-eIF2α抗 體，1∶1 000；抗GAPDH抗 體，1∶50 000）在4℃下孵育過夜。用TBST溶液洗滌10 min×3次，室溫孵育HRP標記的Ⅱ抗（1∶5 000）2 h。用TBST溶液洗滌10 min×3次，使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，對PVDF膜進行逐條檢測，GAPDH作為內(nèi)參照，使用ImageJ軟件對獲取的蛋白條帶進行灰度分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 7.04軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，各實驗獨立重復(fù)3次，組間比較使用單因素方差分析及LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠原代軟骨細胞的培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)36 h后，染色結(jié)果均顯示大鼠軟骨細胞貼壁生長，細胞呈梭形、多角形，呈現(xiàn)典型鋪路石狀。甲苯胺藍染色結(jié)果顯示，軟骨細胞胞質(zhì)呈藍紫色，細胞核呈深藍色。Ⅱ型膠原是軟骨細胞基質(zhì)的主要成分，Ⅱ型膠原的合成和分泌可作為軟骨細胞表型維持和鑒定的特征性指標，光鏡下可見軟骨細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光，見圖1。

Figure 1.Identification of primary rat chondrocytes by staining.A and B：toluidine blue staining；C and D：collagen type II immunofluorescence staining.Scale bar=100 μm in A and C；scale bar=50 μm in B and D.圖1原代大鼠軟骨細胞的染色鑒定

2 白楊素對致炎大鼠軟骨細胞活力的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組軟骨細胞活力顯著降低（P＜0.05）；與LPS組相比，1 mg/L和5 mg/L CHR干預(yù)均可以增加LPS致炎軟骨細胞的活力（P＜0.05），且5 mg/L CHR組效果更優(yōu)（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.Chrysin（CHR）increased the viability of LPS-induced rat chondrocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖2 CHR增強LPS致炎大鼠軟骨細胞的活力

3 白楊素對致炎大鼠軟骨細胞凋亡的影響

流式結(jié)果表明，與對照組比較，LPS組凋亡率顯著增加（P＜0.05）；相較于LPS組，1 mg/L和5 mg/L CHR組凋亡率均顯著降低（P＜0.05）；與1 mg/L CHR組比較，5 mg/L CHR組凋亡率進一步顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 白楊素對凋亡大鼠軟骨細胞核形態(tài)的影響

Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，各組染色標記軟骨細胞核均染成藍色，但LPS組細胞核呈高亮度熒光，熒光強度較對照組顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，1 mg/L和5 mg/L CHR組細胞核熒光強度顯著減弱（P＜0.05）；與1 mg/L CHR組比較，5 mg/L CHR組細胞核熒光強度進一步顯著減弱（P＜0.05），見圖4。

Figure 3.Chrysin（CHR）inhibited LPS-induced apoptosis of rat chondrocytes.The apoptosis was analyzed using Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖3 CHR抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞凋亡

5 白楊素對致炎大鼠軟骨細胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達的影響

與對照組比較，LPS組Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平和Bcl-2/Bax比值顯著下降（P＜0.05）；與LPS組 比 較，1 mg/L和5 mg/L CHR組Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平和Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.05）；與1 mg/L CHR組比較，5 mg/L CHR組Bax、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達水平和Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.05），見圖5。

Figure 4.Chrysin（CHR）improved the nuclear morphology of apoptotic rat chondrocytes.Hoechst 33342 staining was used to observe the nuclear changes of apoptotic cells（scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖4 CHR改善凋亡大鼠軟骨細胞核形態(tài)

6 白楊素對致炎大鼠軟骨細胞GRP78/PERK/CHOP信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較，LPS組GRP78、ATF-6、CHOP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，1 mg/L和5 mg/L CHR組GRP78、ATF-6、CHOP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），且以5 mg/L CHR組效果更顯著（P＜0.05），見圖6。

討 論

黃酮類化合物是治療骨關(guān)節(jié)炎的主要有效成分［12］。本研究探討了黃酮類化合物CHR對致炎軟骨細胞抗凋亡的作用及機制。本實驗首先使用1 mg/L脂多糖誘發(fā)大鼠軟骨細胞炎癥和凋亡，成功建立OA體外實驗細胞模型，值得強調(diào)的是，LPS可刺激細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子，目前已被廣泛用于OA軟骨細胞模型［9-11］，故本研究采用該模型開展了系列實驗，CCK-8實驗結(jié)果表明，CHR可提高OA軟骨細胞活力，Hoechst 33342染色法、流式細胞術(shù)和Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白則顯示了CHR對致炎軟骨細胞凋亡的保護作用。近年來的研究也表明，CHR可通過NF-κB及HMGB1信號通路，提高軟骨細胞活力，抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡［4-5］。在過氧化氫刺激H9c2心肌細胞實驗中，也證實CHR能通過上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）基因表達和減少細胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生來抑制細胞凋亡［13］，這說明CHR具有良好的抗細胞凋亡潛力。此外，本課題組也從分子生物學(xué)層面表明CHR通過激活GRP78/PERK/CHOP信號通路發(fā)揮抗凋亡的作用。

OA作為一種關(guān)節(jié)炎癥性疾病，軟骨細胞凋亡在炎癥引起的病理生理變化過程中起著關(guān)鍵作用，軟骨細胞凋亡更是伴隨著OA的整個病程。OA發(fā)病過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶表達增強加速軟骨細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解導(dǎo)致軟骨細胞的過度凋亡，軟骨逐漸失去正常的生物學(xué)功能，導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍形成和缺失［14］。為控制軟骨細胞的過度凋亡，維持膝關(guān)節(jié)內(nèi)部ECM平衡，軟骨細胞Bcl-2選擇性表達增強，以達到抑制細胞凋亡、延長細胞壽命及延緩OA發(fā)病過程的目的［15］。Bax功能則與Bcl-2作用相反，能夠通過增強線粒體膜通透性的方式促進凋亡，其表達水平的升高更是原發(fā)性O(shè)A的重要原因［16-17］。抗凋亡Bcl-2/促凋亡Bax之間的失衡直接引發(fā)caspase家族的級聯(lián)反應(yīng)，激活caspase-3和caspase-9等凋亡分子，啟動細胞凋亡［18-19］。為進一步探究白楊素抑制軟骨細胞凋亡的可能生物調(diào)控機制，本實驗檢測了凋亡相關(guān)蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值，結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的OA細胞模型中觀察到軟骨細胞凋亡增多，而CHR干預(yù)可升高Bcl-2/Bax比值，并降低cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達水平，抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，提示CHR可通過改善抗凋亡與促凋亡蛋白的失衡以緩解軟骨細胞凋亡。

Figure 5.Chrysin（CHR）ameliorated the imbalance between anti-apoptotic and pro-apoptotic proteins to alleviate rat chondrocyte apoptosis.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖5 CHR改善抗凋亡與促凋亡蛋白的失衡緩解大鼠軟骨細胞凋亡

軟骨細胞凋亡涉及的調(diào)控因子及通路眾多，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/PERK/CHOP就是其中一條重要的信號通路，靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及干預(yù)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號以減少軟骨細胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎治療的有效作用靶點［20］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)下的UPR反應(yīng)通常涉及三種感受器蛋白：ATF-6、PERK和IRE1α［21］。三種感受器在生理條件下與分子伴侶結(jié)合免疫球蛋白（glucose regulated protein 78/binding-immunoglobulin protein，GRP78/Bip）結(jié)合而保持非活性狀態(tài)。當(dāng)感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，GRP78被激活分離，PERK先一步發(fā)生磷酸化，并催化eIF2-α磷酸化，CHOP表達增加，引起B(yǎng)cl-2和caspase家族之間失衡，激活GRP78/PERK/CHOP等一系列凋亡信號及相關(guān)的下游反應(yīng)，最終導(dǎo)致軟骨細胞凋亡［22-23］。本研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的OA細胞模型中觀察到GRP78等ERS相關(guān)因子表達增強，而白楊素處理后，軟骨細胞中GRP78、ATF-6、CHOP、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α表達顯著降低，提示白楊素可能是通過抑制GRP78/PERK/CHOP信號通路活化，以抑制LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡。

綜上所述，本離體實驗研究初步證實白楊素可抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠軟骨細胞凋亡，GRP78/PERK/CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是介導(dǎo)該作用的可能分子機制之一，這使其可成為治療骨關(guān)節(jié)炎新的靶點，并從細胞水平為臨床骨關(guān)節(jié)炎的藥物治療提供了參考資料。

Figure 6.Chrysin（CHR）inhibited the activation of GRP78/PERK/CHOP signaling pathway in rat chondrocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group；△P＜0.05 vs 1 mg/L CHR group.圖6 CHR抑制大鼠軟骨細胞GRP78/PERK/CHOP信號通路活化