基于MMP7/mTORC1信號通路探討小鼠膿毒癥急性腎損傷的分子機制*

丁 璐，柳紅英，王 卉，范桄溥

（1北京人民大學醫(yī)院重癥醫(yī)學科，北京 100044；2北京人民大學醫(yī)院心外科，北京 100044）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥，會導致發(fā)病率和死亡率增加［1］。由于膿毒癥中AKI的病理生理學機制很復雜，目前尚無有效特定療法［2］。因此，早期發(fā)現(xiàn)AKI對于最終制定有效的干預措施至關(guān)重要。最近，研究報道基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）是一種早期無創(chuàng)生物標志物，可預測心臟術(shù)后患者的嚴 重AKI［3］。MMP7是一種 分泌型鋅 和 鈣依賴 性內(nèi)肽酶，其主要功能是通過消化酪蛋白、明膠、纖連蛋白和蛋白聚糖來分解細胞外基質(zhì)。MMP7還能夠切割其他底物，并在E-cadherin胞外域脫落、TNF-α釋放和其他蛋白酶的激活中發(fā)揮作用［4-5］。MMP7的這種能夠作用于大量底物的能力，使其成為控制廣泛生物過程（如組織重塑、細胞凋亡和炎癥）的潛在參與者［6］。然而，MMP7在膿毒癥AKI發(fā)病機制中的作用是完全未知的。在本研究中，我們觀察了MMP7在盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）小鼠中的變化，并使用內(nèi)源性MMP7缺失小鼠和外源性MMP7重組蛋白來分析MMP7在CLP介導的膿毒癥期間對腎損傷的作用。

材料和方法

1 動物

從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［生成許可證號：SCXK（京）2016-0006］購買SPF級、8周齡、雄性、具有C57BL/6J遺傳背景的MMP7敲除（MMP7-KO）小鼠（18～22 g），以及年齡和性別匹配的C57BL/6J小鼠（18～22 g）用作野生型（wild-type，WT）對照，共88只。

2 細胞、試劑和儀器

人近端腎小管上皮細胞系HKC-8購自ScienCell Research。載體或MMP7重組蛋白購自EMD Chemicals；HE染色試劑盒購自Beyotime；兔抗中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）多克隆抗體購自Invitrogen；HRP偶聯(lián)的Ⅱ抗購自Jackson ImmunoResearch；DAB反應緩沖液購自武漢谷歌生物科技有限公司；原位細胞死亡檢測試劑盒和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自Sigma；抗Na+-K+-2Cl-共轉(zhuǎn)運體2（Na+-K+-2Cl-cotransporter 2，NKCC2）抗體購自Alpha Diagnostic International；抗Na+-Cl-共轉(zhuǎn)運體（Na+-Cl-cotransporter，NCC）抗體購自Biosciences；Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 488偶聯(lián)的Ⅱ抗購自Molecular Probes；四棱蓮凝集素染色的切片、熒光素標記的四棱蓮凝集素、生物素化的Dolicos biflorus凝集素和熒光素avidin D購自Vector Laboratories；蛋白提取試劑盒購自TaKaRa；二辛可寧酸試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；聚偏氟乙烯膜購自Bio-Rad；兔抗MMP7單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗購自Cell Signaling Technology；兔抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）多克隆抗體購自Abcam。加熱墊購自Physitemp Instruments；Vitros 250 Analyzer購 自Johnson & Johnson；熒光顯微鏡購自Hitachi。

3 主要方法

3.1 小鼠分組在實驗1中，WT小鼠隨機分配到以下2組：假手術(shù)（sham）組和膿毒癥（CLP）組，每組18只。假手術(shù)組小鼠接受剖腹手術(shù)但沒有進行CLP術(shù)；CLP組小鼠建立CLP模型。分別在術(shù)后0、3、6、18、24和48 h處死小鼠，每個時點各組選取3只。實驗2檢驗內(nèi)源性MMP7缺失對CLP誘導AKI的影響，分別將MMP7-KO小鼠和WT小鼠各自隨機分配到假手術(shù)組和CLP組，每組8只。在術(shù)后24 h處死小鼠。實驗3檢驗外源性MMP7對CLP誘導AKI的影響，MMP7-KO小鼠隨機分配到CLP+vector組和CLP+MMP7組，每組10只，在CLP術(shù)前24 h通過尾靜脈以0.4 mg/kg向小鼠注射載體或MMP7重組蛋白，術(shù)后24 h處死小鼠。

3.2 膿毒癥模型建立和標本采集參照文獻方法建立CLP模型以誘發(fā)膿毒癥［7］。具體操作為：在用2%異氟醚麻醉的情況下，將動物置于加熱墊上以將體溫保持在37℃。皮膚消毒后，在腹部中線切開1 cm，暴露盲腸。在遠端和盲腸基部之間的中間結(jié)扎以誘導中度膿毒癥。在結(jié)扎部位和盲腸尖端之間用一根21G的針刺穿整個盲腸。少量糞便通過穿刺部位擠出。將盲腸放回腹部，用無菌6-0絲線縫合腹膜、筋膜和腹部肌肉組織。皮膚用金屬夾閉合。用0.25%布比卡因浸潤至手術(shù)部位。手術(shù)后再次進行皮膚消毒。對于接受手術(shù)的動物，皮下注射50 mL/kg生理鹽水。假手術(shù)組的動物接受相同的手術(shù)程序但沒有進行CLP。使用代謝籠來監(jiān)測術(shù)后尿量，尿量＜0.5 mL/（kg·h）為少尿［8］。在預先指定的安樂死時間處死小鼠后，立即進行了體內(nèi)雙側(cè)腎切除術(shù)，以盡量減少潛在的混雜缺血。一個腎臟立即在4%多聚甲醛中固定24 h，另一個放入液氮中保存。然后通過心臟穿刺對小鼠進行放血，血液用于即時檢測。

3.3 血尿素氮和血清肌酐測量收集血液，在室溫下保持30 min，并分離血清（3 600×g，10 min）。在Vitros 250 Analyzer使用毛細管電泳測量血尿素氮和血清肌酐。結(jié)果以mg/dL表示。

3.4 腎損傷評估將腎組織用4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中，并以4 μm切片。按照標準程序使用HE染色試劑盒染色，具有以下組織病理學變化的腎小管被認為受損：刷狀緣缺失、腎小管擴張和破裂、管型形成和細胞溶解。以盲法檢查組織損傷，并以損傷小管的百分比評分：0表示無損傷；1表示＜25%；2表示25%～50%；3表示50%～75%；4表示＞75%。對于免疫組化染色，將石蠟包埋的腎切片與0.1 mmol/L Tris-EDTA緩沖液（pH 9.0）在100℃孵育15 min進行抗原修復。冷卻至室溫后，將切片浸入0.3%過氧化氫中10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。隨后與5% BSA和0.1% Triton X-100孵育以減少非特異性結(jié)合后，室溫下NGAL抗體（1∶200稀釋）孵育1 h，然后用HRP偶聯(lián)的Ⅱ抗室溫下孵育1 h。將載玻片浸入DAB反應緩沖液中，隨機選擇10～15個區(qū)域進行量化。對于凋亡檢測，通過TUNEL法確定腎臟的細胞凋亡情況。使用原位細胞死亡檢測試劑盒進行TUNEL測定，將載玻片脫蠟并在室溫下與蛋白酶K（20 g/L）一起孵育15 min，然后將載玻片與TUNEL反應混合物在濕盒中室溫孵育1 h。此外，Hoechst 33342用于標記細胞核。隨機選擇10～15個視野用于量化TUNEL陽性細胞。

3.5 免疫熒光8 μm冷凍切片用磷酸鹽緩沖液洗滌，用5% BSA/PBS封閉（室溫1 h），與Ⅰ抗（抗MMP7，1∶50；抗NKCC2或抗NCC，1∶200）在4℃下孵育過夜，并通過與Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 488偶聯(lián)的Ⅱ抗（1∶500）檢測。在洗滌前，將用四棱蓮凝集素染色的切片與熒光素標記的四棱蓮凝集素（1∶500）在室溫下孵育30 min。用生物素化的Dolicos biflorus凝集素（1∶400）染色的切片在4℃下孵育過夜，并通過熒光素avidin D（1∶500）檢測。

3.6 細胞和分組處理HKC-8細胞在含有10%FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d傳代一次，取第3代細胞用于實驗。將細胞分為：對照（control）組、LPS組、LPS+vector組和LPS+MMP7組。除對照組外，各組細胞暴露于LPS（10 mg/L）中6 h。LPS+vector組和LPS+MMP7組在暴露于LPS前6 h，將細胞與vector或人MMP-7重組蛋白（25 nmol/L）孵育。

3.7 Hoechst 33342染色收集處理后的細胞，棄去培養(yǎng)液。在37℃、黑暗處用Hoechst 33342溶液（10 μL）浸泡10 min。隨后用PI（5 μL）在37℃對細胞進行染色。在黑暗中持續(xù)10 min。用熒光顯微鏡觀察染色細胞的形態(tài)。

3.8 Western blot按照蛋白提取試劑盒說明書提取各組腎臟組織和細胞總蛋白，蛋白含量用二辛可寧酸試劑盒測定。提取的蛋白質(zhì)與上樣緩沖液充分混合，在100℃下煮沸10 min進行變性，每個孔上樣30 μg樣品。接下來，蛋白質(zhì)通過10%SDS-PAGE轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，并在含有5%脫脂牛奶的吐溫20的Tris緩沖鹽水中封閉1 h。隨后，將膜與抗MMP7、mTORC1或GAPDH抗體（1∶1 000）的Ⅰ抗一起孵育過夜，然后用相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（1∶1 000）孵育2 h。在暗處加入增強化學發(fā)光溶液進行顯色。以GAPDH為內(nèi)參照，用Cel-Pro Analyzer分析目標條帶的灰度值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差（mean±SD）表示。通過雙向重復測量ANOVA分析來自不同組實驗的測試數(shù)據(jù)。Shapiro-Wilk檢驗用于確定數(shù)據(jù)的分布。由于所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，因此采用單因素方差分析和Tukey檢驗來分析數(shù)據(jù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 CLP引起尿量、血尿素氮和血清肌酐的變化

與假手術(shù)組相比，CLP組在CLP后6 h內(nèi)尿量減少（P＜0.05），這種下降趨勢在后來的時點持續(xù)存在，并且在CLP 18 h后尿量均低于0.5 mL/（kg·h）。此外，與假手術(shù)組相比，CLP組血尿素氮水平在CLP后6 h顯著升高（7～69 mg/dL，P＜0.01）；CLP后血清肌酐也于CLP后24 h升高（P=0.05），并且在48 h時仍升高。見圖1。

2 CLP對腎臟中MMP7表達的影響

與假手術(shù)組相比，CLP后6 h腎臟組織中MMP7蛋白表達降低，這種降低持續(xù)到48 h，見圖2A。此外，免疫熒光染色顯示在假手術(shù)組小鼠的腎臟中，MMP7主要在腎皮質(zhì)中和Na+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白陽性小管（遠端回旋）中表達，在腎髓質(zhì)中的表達較少，見圖2B。

3 內(nèi)源性MMP7缺失加重CLP誘導的AKI

接下來我們利用內(nèi)源性MMP7缺失（MMP7-KO）小鼠研究MMP7在AKI發(fā)病機制中的作用，其中MMP7基因被全身敲除（圖3A）。MMP7-KO小鼠表型正常，沒有明顯的物理或形態(tài)學異常。在CLP后24 h，與WT CLP小鼠相比，MMP7-KO CLP小鼠腎臟表現(xiàn)出更嚴重的形態(tài)損傷，尤其是在腎皮質(zhì)和外髓質(zhì)表現(xiàn)出廣泛的小管損傷，包括刷狀緣丟失、管狀鑄型形成及細胞脫落到管狀腔中（圖3B）。MMP7-KO CLP組小鼠腎小管損傷病理評分、NGAL水平和TUNEL陽性腎小管細胞顯著高于WT CLP組小鼠（P＜0.01），見圖3B～E。

Figure 1.CLP caused changes in urine output，blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h；#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group.圖1 CLP引起尿量、血尿素氮和肌酐的變化

Figure 2.CLP decreased MMP7 expression in mouse kidneys.A：Western blot detection of MMP7 protein expression in kidney tissues at different time points after CLP；B：representative images of co-staining with MMP7 antibody and nephron segmentspecific markers 24 h after CLP（scale bar=20 μm）.DBA：Dolichos biflorus agglutinin；LTA：Lotus tetragonolobus agglutinin；NCC：Na+-Cl-cotransporter；NKCC2：Na+-K+-2Cl-cotransporter 2.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs sham group.圖2 CLP誘導的膿毒癥小鼠腎臟中MMP7的表達減少

4 MMP7在體外可減輕腎小管細胞凋亡

如圖4A所示，HKC-8在與LPS孵育后，檢測到大量細胞凋亡；而MMP7重組蛋白孵育在很大程度上減輕來自LPS誘導的細胞凋亡。Western blot分析表明，LPS誘導了mTORC1表達，而MMP7可以抑制LPS誘導的mTORC1表達（圖4B）。然后我們探討了MMP7是否可以通過其蛋白水解活性直接消化mTORC1。在無細胞試管中將全長mTORC1蛋白與MMP7一起孵育，如圖4C所示，MMP7能夠明顯切割mTORC1，產(chǎn)生分子量為18 kD的較小片段。此外，MMP抑制劑II（一種MMP7選擇性抑制劑）阻止了MMP7介導的mTORC1降解（圖4D）。

5 外源性MMP7對CLP誘導AKI的腎臟保護

為了進一步證實MMP7在AKI中的作用，我們通過在MMP7-KO小鼠中注射外源性MMP7進行了救援實驗，結(jié)果顯示小鼠腎組織中MMP7表達顯著增加（圖5A）。在CLP后1 d，與載體對照相比，接受外源性MMP7的MMP7-KO小鼠腎小管損傷病理評分、NGAL水平、TUNEL陽性腎小管細胞和mTORC1蛋白表達顯著降低（P＜0.01），見圖5B～E。

討 論

在本研究中，我們使用體內(nèi)MMP7-KO小鼠作為研究對象，并采用CLP法誘導膿毒癥模型。與嚙齒動物中使用的許多其他膿毒癥模型（例如內(nèi)毒素血癥）相比，CLP能更可靠地概括了人類疾病的許多方面［9］。此外，在代謝籠中單獨飼養(yǎng)小鼠可能會重現(xiàn)慢性日常壓力，這被證明是動物膿毒癥建模的重要組成部分［10］。膿毒癥是一種異質(zhì)的臨床實體關(guān)于部位、物種和對感染的反應，限制了所有標準化嘗試在體內(nèi)模擬該綜合征的適用性。盡管有這些限制，我們的研究結(jié)果在病理生理學上與大型哺乳動物和人類患者的研究結(jié)果一致［11］。在此基礎(chǔ)上，我們調(diào)查了MMP7對膿毒癥期間AKI的影響。結(jié)果顯示，MMP7通過減輕腎小管細胞凋亡具有腎臟保護作用。此外，MMP7的腎保護機制可能與直接降解mTORC1有關(guān)。這些結(jié)果表明，MMP7可作為膿毒癥AKI的潛在治療靶點。

Figure 3.Endogenous MMP7 deletion（MMP7-KO）aggravated CLP-induced AKI.A：the protein levels of MMP7 in kidney tissues of wild-type（WT）and MMP7-KO mice；B：HE staining，NGAL immunohistochemical staining and TUNEL staining were used to assess renal pathology，tubular damage and tubular apoptosis after CLP，respectively（scale bar=50 μm）；C：pathological score of renal tubular injury；D：densitometry of NGAL signal after CLP；E：quantification of TUNEL-positive cells.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs sham（WT）group；##P＜0.01 sham（MMP7-KO）group；△△P＜0.01 vs CLP（WT）group.圖3內(nèi)源性MMP7缺失（MMP7-KO）加重CLP誘導的AKI

Figure 4.MMP7 protected renal tubular cells from apoptosis by cleaving mTORC1 in vitro.A：Hoechst 33342/PI staining evaluated the effect of MMP7 recombinant protein on LPS-induced apoptosis of HKC-8 cells；B：representative Western blot showing the effect of MMP7 recombinant protein on LPS-induced mTORC1 protein expression in HKC-8 cells；C：representative SDS-PAGE showing that MMP7 directly degrades mTORC1；D：Western blot analysis showing mTORC1 and its degraded fragments after incubation with MMP7 in the absence or presence of MMP inhibitor II.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs LPS+vector group.圖4 MMP7在體外通過切割mTORC1減輕腎小管細胞凋亡

Figure 5.Renal protective effect of exogenous MMP7 on CLP-induced AKI.A：MMP7 recombinant protein up-regulated the protein level of MMP7 in kidney tissues of MMP7-KO mice；B：HE staining，NGAL immunohistochemical staining and TUNEL staining were used to evaluate the effects of MMP7 recombinant protein on renal pathology，renal tubular injury and renal tubular apoptosis in MMP7-KO mice after CLP，respectively（scale bar=50 μm）；C：pathological score of renal tubular injury；D：densitometry of NGAL signal；E：quantification of TUNEL-positive cells；F：Western blot showing the effect of MMP7 recombinant protein on mTORC1 protein expression in MMP7-KO mouse kidney tissues.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs CLP+vector group.圖5外源性MMP7對CLP誘導AKI的影響

眾所周知，由于高能量消耗，近端腎小管上皮特別容易受到CLP損傷［12］。大量研究表明，在急性腎功能衰竭的病理生理學中，腎小管上皮從基底膜上脫落［13-14］。然而，并非所有從基底膜脫落的管狀細胞都是細胞壞死或凋亡性死亡，有些仍然存活。此外，腎小管上皮的連接不穩(wěn)定性會進一步促進腎損傷［15］。本研究證實了CLP后腎小管細胞凋亡顯著增加，并且腎小管中MMP7顯著下調(diào)。MMP7是一種鋅和鈣依賴性內(nèi)肽酶，它可以降解多種底物，例如細胞外基質(zhì)和細胞-細胞粘附蛋白，調(diào)節(jié)細胞遷移和炎癥反應［16-17］。從腎上皮合成的MMP7減少可導致蛋白尿性慢性腎病中的腎素耗竭和腎小球通透性受損［18］。此外，MMP7的缺失還與AKI中幾種促炎細胞因子（如MCP-1、TNF-α和RANTES）的表達增加有關(guān)，它們調(diào)節(jié)炎癥反應和機體免疫參與AKI進展［5］。與AKI患者尿液中MMP7降低一致［4］，本研究中CLP誘導的AKI模型中腎臟MMP7的表達顯著降低。MMP7蛋白主要定位于近端小管。這些結(jié)果表明AKI患者的尿MMP7減少最有可能與受傷的小管釋放減少有關(guān)。

mTORC1在腎臟疾病中的作用已被廣泛研究。用雷帕霉素抑制mTORC1可抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化［19］。此外，腎組織中mTORC1的異常激活會導致一系列以細胞生長、增殖和分化異常為特征的疾病，如PKD、腎細胞癌和腎小球硬化［20］。本研究在CLP誘導的AKI中觀察到MMP7的敲 除誘 導mTORC1表 達，表明MMP7抑制mTORC1介導的凋亡途徑。這一結(jié)論得到了幾條證據(jù)的支持。首先，MMP7的缺失會進一步增加CLP誘導的腎小管凋亡細胞。其次，MMP7可以在非細胞系統(tǒng)中直接切割純化的mTORC1蛋白，證實了其通過蛋白水解降解破壞mTORC1的能力。第三，救援實驗證實MMP7通過抑制MMP7缺失小鼠中的mTORC1活化來減輕CLP后的細胞凋亡。

總之，本研究表明，腎臟MMP7下調(diào)可促進小鼠膿毒癥AKI發(fā)生發(fā)展。MMP7通過降解mTORC1減輕細胞凋亡，從而具有腎臟保護作用。因此，膿毒癥AKI后早期誘導MMP7可能是腎臟啟動腎小管存活所必需的。