基于細胞代謝組學的藥物研究方法及應用*

王艷麗，劉春花，潘 潔，孫 佳，劉 亭，李勇軍2，，陸 苑△

（1貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室&省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽550004；2貴州醫科大學藥學院，貴州貴陽550004；3貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州貴陽550004）

生命科學研究促進了組學技術的發展，除了基因組、轉錄組和蛋白組可以從基因和蛋白功能等方面揭示生命科學活動外，生物體內還存在著十分精細的調控體系，既有直接參與能量代謝的糖類、脂質及其中間代謝物，也有對新陳代謝起重要調節作用的物質，它們在體內形成相互關聯的代謝網絡，共同參與對生命活動的調控。對于這些物質的研究，傳統方法以生理學和藥理學結合的針對性研究為主，缺乏高通量的整體研究技術，基于此代謝組學應運而生［1］。代謝組學通過動態監測細胞、組織或其它生物體系受刺激或擾動后（某個特定的基因變異或環境變化），相對分子質量小于1 000的內源性小分子的變化，以此闡明生物體系的代謝途徑、揭示機體生命活動代謝本質［2］。不同組學在解釋生命活動變化中具有不同的側重點，其中代謝組學處于生物流調控的末端，更接近疾病表型。與其它組學相比，代謝組學研究具有以下特點（表1），已成為系統生物學研究的重要手段［3］。

表1 代謝組學技術的特征優勢Table 1.Features and advantages of metabolomics study

細胞是生物體結構和功能的基本單位，其代謝物組成是遺傳特征、基因表達調控、蛋白質表達和環境影響共同調控的結果［4］。細胞代謝組學可通過對不同生理狀態下細胞內外小分子代謝物的定性、定量分析，找出與疾病發生和治療相關的關鍵代謝物，解釋作用機制。

目前代謝組學的研究大多基于動物樣本（血液、尿液及組織等）進行，但其與人類的種屬差異性以及代謝物極易受多種因素影響（如年齡、外界環境等），都會使實驗結果產生偏差［5］。而細胞代謝組學則可借助于各種人源細胞模型，直接反映細胞生命活動的生物標志物信息。此外，細胞受外界因素影響較小、實驗變化易于控制、實驗重現性高、成本較低、結果更易解釋，其代謝組學研究已被廣泛應用于藥物機制探究、毒理學評價以及中藥活性成分篩選等領域［6-7］。本文將對其從研究流程和相關應用等方面進行相應的論述，旨在更全面地理解細胞代謝組學的研究發展。

1 細胞代謝組學的研究流程

細胞代謝組學實驗是對細胞內和細胞外代謝物的定性、定量分析過程，主要流程為細胞處理、數據采集、數據分析和代謝標志物分析（圖1）。

Figure 1.Research process of cell metabolomics.圖1細胞代謝組學研究流程

1.1 細胞處理簡單、快速且重現性好的處理方案是細胞代謝組學研究的基本要求。為此，研究人員需從以下因素進行考慮。

1.1.1 細胞培養細胞代謝組學研究通常選擇各種哺乳動物細胞，包括原代細胞和可連續傳代的細胞系。原代細胞保留了原有組織中大部分表型特征，可反映體內環境，是探究特定組織代謝和生化途徑的首選體外模型［8］。然而由于原代細胞樣本來源珍貴，特別是人類來源的原代細胞，細胞增殖速度慢且培養條件較嚴格，一定程度上限制了其在代謝組學研究中的應用。盡管其他來源細胞系（如肝、腎、肺、血、卵巢等）的代謝功能不同于原代細胞，但它們具有諸多優點，如易處理、幾乎無限的壽命、標準化的培養條件以及不依賴于供體特征的穩定表型等，這使得其在代謝組學研究中被廣泛應用［9］。

無論是原代細胞還是細胞系，合適的培養條件始終是細胞生長繁殖所必需的，因此培養基配方對細胞功能和新陳代謝的影響不容忽視。一項腫瘤細胞代謝組學研究中對比了199培養基、199培養基含2%胎牛血清、DMEM培養基、DMEM培養基含2%胎牛血清以及克-漢二氏重碳酸鹽緩沖液，5種不同培養基對代謝物的影響，結果顯示細胞內和細胞外代謝物種類和含量均有不同程度的改變［10］。另外，一項基于核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術的人胰腺癌細胞系的代謝組學研究也揭示培養基會顯著影響細胞的代謝輪廓特征，因此在設計代謝分析研究時應將培養基視為一個重要變量［11］。

在細胞培養研究中，一般認為純化學合成培養基優于天然培養基。合成的純化學培養基是已知量的高純度化學試劑與蒸餾水配制而成，所含的成分（包括碳水化合物、各種無機鹽、維生素和微量元素等）以及用量均確切可知。對于細胞代謝組學而言，往往需要考慮對培養基條件進行優化，以期獲得最全面和精準的代謝輪廓。然而，過度優化的培養基條件卻可能造成細胞生長抑制，對細胞培養的效果不如天然培養基［12］。復雜的天然培養基，如牛血清或胎牛血清，含有豐富的細胞生長必須的營養成分，培養效果好，廣泛用于動物細胞的體外培養，缺點是成分復雜，批次間差異大。有研究表明血清類型和批次等的變化均可能導致外源性代謝物的污染和內源性細胞代謝物的改變［12］。因此在進行細胞代謝組學研究時，應在充分考慮研究目的和細胞生長特性的前提下選擇合適的培養基，盡可能選擇同一供應商來源的產品，同時盡量避免批次間的誤差，以減少代謝差異。

細胞密度是可能導致細胞代謝輪廓改變的另一個重要因素。培養的不同密度的細胞可能處于細胞增殖期或生長停滯期，其代謝物輪廓可能會因此會產生差異。Miccheli等［13］對處于不同細胞密度的HepG2細胞進行了基于NMR的代謝組學分析，結果得到兩種完全不同的代謝譜圖，這證實了細胞密度對代謝輪廓的影響。目前，關于哺乳動物細胞代謝組學的多項研究都沒有對細胞接種密度進行標準化規定。一般建議懸浮細胞的接種密度至少為1×107mL-1，但（2～50）×105mL-1的接種密度也被應用［14-15］。不同類型貼壁細胞的接種密度也表現出多樣化，如HepG2細胞為0.2×105cm-2、原代人類肝細胞為1.7×105cm-2以及人類胚胎干細胞為7×105cm-2等［16-17］，實際培養中仍需要根據所用細胞的生長特性進行選擇。此外，研究還指出細胞傳代數和表型差異也可能改變細胞代謝譜，在設計實驗時應考慮［18］。總之，細胞培養是影響代謝輪廓的重要變量，涉及多方面的因素，實際操作中應盡可能減少差異條件，更好地控制細胞生長指數和表型穩定性，以保證代謝輪廓結果的可靠性和真實性。

1.1.2 細胞淬滅細胞淬滅是抑制細胞內酶活性，阻止代謝物變化的關鍵步驟。由于細胞代謝活動離不開酶的催化，部分代謝物能夠在毫秒間實現代謝轉化，如三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）為1.5 mmol/s、二 磷 酸 腺 苷（adenosine diphosphate，ADP）為2.0 mmol/s和D-葡萄糖為1.0 mmol/s［18-19］，而代謝組學僅能反映某一時刻下機體的代謝輪廓，因此提取前快速的細胞淬滅是保證代謝物水平微小變化以及避免偏差性結果的先決條件［15］。典型的淬滅技術多基于低溫或酶變性原理進行，具體包括液氮淬滅、快速冷凍和添加冷有機溶劑等［20-21］。對于單獨分析細胞內和細胞外的代謝物而言，淬滅技術還應盡可能保證細胞膜的完整性，避免胞內外代謝物的相互干擾［22］。多項研究發現，基于冷甲醇的淬滅可能造成胞內代謝物的流失，隨著甲醇濃度的降低，代謝物信息損失顯著降低［23-24］。Dietmair等［25］發現60%甲醇也會破壞細胞膜結構，而冰冷的0.9%生理鹽水的淬滅則能在保證細胞膜完整性的同時，有效阻止ATP等高能物質的生物轉化。此外，Kapoore等［26］研究指出60%甲醇和4-羥乙基哌嗪乙磺酸等不同緩沖鹽添加劑的組合也是減少細胞內代謝物泄漏的有效淬滅方法。

不同細胞類型，淬滅方案亦有不同。Kostidis等［22］研究指出，懸浮細胞中以-40℃提前預冷的甲醇（含0.85%的碳酸氫銨）作為淬滅溶劑，隨后在-20℃下以1 000 r/min離心1 min，可在保證細胞膜完整性的前提下，使胞內外代謝物充分分離并減少代謝失活。貼壁細胞則可以先通過低溫快速移取的方法進行細胞內外代謝物的分離（必要時進行離心），隨后用冰冷的磷酸鹽緩沖液或0.9%生理鹽水洗滌，這不僅能夠去除培養皿的殘留，還能有效減緩細胞的代謝活動，為代謝物的淬滅操作提供時間［21］。常用技術中，液氮淬滅被認為是簡單、快速和高效的方法，而且液氮的快速處理可對細胞膜形成即時的損傷，有利于后續的代謝物提取［21，27］。除了上述方法外，部分基于熱甲醇、熱乙醇、甲醇-氯仿、酸、堿和熱水等進行的細胞淬滅也取得了一定效果［16］，實際應用中應根據細胞類型和實驗目標進行選擇及優化。

1.1.3 細胞提取細胞提取是代謝物充分釋放的過程，有效的提取方法應以獲得最全面的代謝輪廓為前提。提取溶劑是決定代謝物提取量的重要因素之一。普遍認為以甲醇-水、乙腈-水以及氯仿等有機溶劑為代表的液-液萃取法是較好的選擇。為此，一些研究在充分考慮并評估代謝物回收率后，認為50%乙腈、82%甲醇、90%甲醇-氯仿以及純甲醇等作為提取溶劑的方案可被普遍應用［25，28］。此外，對不同目標代謝物提取條件的方法優化也被廣泛探討，Lorenz等基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用（UPLC-QTOF-MS）技術，分別以乙腈、乙醇、甲醇、70%甲醇和75%甲醇-氯仿混合溶液（9∶1）作為提取溶劑，通過對參與糖酵解和三羧酸循環的27種代謝物定量分析比較，發現75%甲醇-氯仿混合溶液的提取可以最大程度上保證代謝物的回收率和穩定性［28］。而對于還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、ATP等高能代謝物，常規的淬滅方式難以完全立即終止酶的活性，造成其進一步轉化成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（AMP）等其它代謝物。因此，對這些代謝物的提取，Jang等［20］建議采用有機溶劑加酸的方法進行，其中以乙腈∶甲醇∶水（2∶2∶1）與0.1 mol/L甲酸的混合溶液作為提取溶劑，幾分鐘后加入碳酸氫鹽以中和樣品的方法能夠有效地提取這些代謝物。Dietmair等［25］則通過比較混合標準品中核苷酸（尿嘧啶和腺嘌呤等）、氨基酸（精氨酸和亮氨酸等）和有機酸（檸檬酸和富馬酸等）等物質的代謝回收率，對乙腈、甲醇及甲醇-氯仿等12種常用提取方案進行評價，結果表明50%乙腈的提取方法可獲得較好的代謝回收率，適用于此類物質的提取。除了根據實驗目的和代謝物的理化性質（如極性大小）選用合適溶劑提取外，細胞的破碎程度也十分重要，如超聲處理、機械均質化和凍融循環均能有效增強細胞通透性，實驗中可根據具體條件進行選擇。

溫度是影響代謝物提取產量的另一個因素，為了避免代謝物的進一步轉化降解，有研究建議提取過程應盡量保持低于-20℃的低溫環境，實驗中可通過調節提取溶劑的溫度進行控制［23］。Kostidis等［21］研究表明，以-80℃的有機溶劑進行提取，可獲得較全面和重復性高的實驗結果。盡管還有報道指出，過低的溶劑溫度可能會降低代謝物的溶解度，不利于代謝組學分析［25］，但-40℃、-20℃及4℃等不同溫度的提取溶劑仍常用［29］。總之，目前尚無針對某一類型細胞或特定代謝物的標準化提取方法，實驗中仍需要綜合考慮。

1.2 數據采集代謝組學的分析方法要求具有高靈敏度、高通量以及無偏向性等特點，然而生物代謝物的復雜性，使得這一目標往往需要多種分析手段的結合才能實現，基于NMR或質譜（mass spectrometry，MS）系統的分析是目前代謝組學研究中的主要手段。

1.2.1 基于NMR的檢測技術NMR可用于結構解析和定量，具有快速測定和高度重現性等優勢，已被大量用于代謝組學研究中。NMR檢測對樣品的處理和分析要求較為簡單，基本可實現樣品的無創性和無偏向性檢測要求，有效地保證了原始代謝信息的完整性和客觀性，尤其以1H-NMR為主的代謝組學分析被廣泛應用，如唐孟秋等利用1H-NMR技術檢測得到人參煎治療2型糖尿病的代謝標志物，包括甘氨酸、α-葡萄糖和β-葡萄糖等血清代謝物以及牛磺酸和肌酸等尿液代謝物［30］；Zhang等［31］通過1H-NMR測定臨床高尿酸患者的代謝譜，揭示了疾病可能的作用機制。然而，NMR的主要缺點在于檢測靈敏度和分辨率較低，無法滿足低豐度代謝物的準確檢測。為此研究人員通過配備超低溫探頭，以提高NMR技術的靈敏度［32］。同時，高分辨率魔角旋轉（high-resolution magic angle spinning，HR-MAS）及液相色譜-NMR聯用（liquid chromatography-NMR，LC-NMR）等技術被用于提高測定分辨率［33］，目前這些技術也逐漸被用于代謝組學研究中，例如，Akira等［34］在遺傳性高血壓大鼠中，利用LC-NMR技術測定到與牛磺酸結構相似的低豐度琥珀酰牛磺酸，這為遺傳性高血壓疾病的探究提供了新的切入點。Gogiashvili等［35］采用HR-MAS技術為乳腺癌患者的40種代謝物提供了準確的定性、定量信息。這些技術的使用有效地擴展了以NMR為分析手段的代謝組學在藥物毒性、基因功能以及臨床疾病診斷等方面的應用。

1.2.2 基于MS的檢測技術MS技術因具有較高的靈敏度和專屬性被廣泛應用，特別是基于分離的MS技術可通過對樣品進行預先分離，從而提高代謝物的覆蓋率，其中以液質聯用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）和氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）最為常用。GCMS因具有高分辨率、高靈敏度、標準的代謝數據庫（如NIST、Willey等多種數據庫）以及易于定性等優點，多用于代謝組學研究中。如常晉霞等［36］基于GCMS代謝組學方法，鑒定出多個與刺五加總苷提取物治療糖尿病密切相關的代謝物，包括氨基酸、脂肪酸和有機酸等物質。但GC-MS多適用于揮發性化合物（如甾醇類、醋酸鹽類等）或極性較小化合物的檢測（如短鏈脂肪酸），且檢測樣本多需進行衍生化操作，預處理繁瑣。而LC-MS除具有較高分辨率和靈敏度外，還擁有較寬的動態檢測范圍，可覆蓋多數中高極性化合物的分析（如脂質、核苷酸、糖類等）。此外，LC-MS分析還能夠有效避免GC-MS中繁雜的樣品前處理，且代謝物數據庫信息更為全面而被廣泛應用。LC-MS分析中，合適的分離系統是影響代謝物檢測偏向性的重要因素，其中基于反相色譜的預分離僅適用于極性相對較小的脂質、有機酸等代謝物，而糖類、氨基酸等多數親水性代謝物則表現出弱保留行為［20］。因此為了獲得更全面的代謝物信息，建議將不同分離性質色譜柱的分析結果相互補充。如Palmer等［35］利用互補的親水色譜柱（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）和反相C18色譜柱得到了更為全面代謝物信息。D′Elia等［37］基于HILIC和C18色譜柱的UHPLC-MS技術，全面評估了與蓖麻毒素中毒密切相關的代謝標志物。此外，二維液相系統的發展為樣品在反相和親水作用色譜柱的同時檢測提供了可能。其它的分析技術，如毛細管電泳-質譜、傅里葉變換離子回旋共振質譜以及毛細管高效液相色譜-質譜等多種檢測手段也在不斷探索中。

目前，尚無一種分析技術能夠達到代謝組學分析全面性的要求，為此多種分析平臺的結合在代謝組學研究中備受關注，其可通過信息互補來提高代謝物的覆蓋率。研究已經總結出多種針對哺乳動物細胞代謝組學的分析平臺［9］，并對基于NMR和MS技術的代謝分析特征進行了具體的比較［38］，實驗者可根據研究重點或實驗條件進行選擇。

1.3 數據分析代謝組學得到的是大量、多維的數據信息，而樣品制備和儀器分析中引入的微小誤差，很可能造成代謝物信息的偏差或缺失［5］。因此，為了準確挖掘所獲得數據中的潛在信息，對原始數據矩陣的分析處理十分重要。細胞代謝組學研究的數據處理包括數據歸一化以及基于統計分析的數據挖掘。

1.3.1 數據歸一化代謝物的準確定量關乎后續數據建模和代謝標志物挖掘的可靠性，然而細胞代謝組學研究中，細胞密度和處理條件的微小變化往往造成細胞的增殖差異，使其難以在同一水平上進行代謝物濃度的比較，最終導致實驗結果的偏差，因此需要對原始數據進行歸一化處理［7，28］。目前，常用的歸一化方法包括細胞數量歸一化、蛋白質濃度歸一化以及DNA濃度歸一化［9］。不同研究者也對它們的合理性進行了比較或考察，如Muschet等［39］開發了一種基于熒光的DNA定量方法，用于測定代謝組學樣品中的細胞數量，結果發現大多數代謝物（占比約82%～97%）的濃度與細胞數量呈線性正相關，這為細胞數量歸一化的合理應用提供了依據。Cao等［28］利用氣相色譜-飛行時間質譜法對兩種不同細胞系中存在的11種代謝標志物進行測定，結果發現這些代謝物的信號強度與蛋白質含量呈現良好的線性關系，證明了蛋白濃度歸一化的可行性。Silva等［40］則對細胞數量歸一化、蛋白質濃度歸一化和DNA濃度歸一化方法進行了比較，結果發現DNA濃度與細胞接種數量的相關性最強，且這種歸一化方法能有效避免成團生長的細胞系難以準確計數和由提取溶劑可能引起的蛋白質回收率差等問題，更適用于貼壁細胞數據的歸一化處理。Abdel等［41］對糖酵解生物途徑的相關代謝物進行靶向分析，并將三種細胞系所獲得的數據分別進行細胞數量和DNA濃度歸一化處理，結果顯示這兩種歸一化方式的分析結果無明顯差異。此外，還有研究者在基于GC-MS探究乳腺癌細胞的代謝輪廓時，發現總離子流圖和細胞數量歸一化的結果相似，因此后續分析可選擇省略細胞數量歸一化的步驟［42］。盡管有研究認為，在多種歸一化方式中，細胞數量歸一化是最常用的方式［6］，但實驗時仍需根據不同細胞系間的差異和操作可行性等問題選擇合適的歸一化方法。

1.3.2 數據統計分析基于NMR和MS的代謝組學研究都會生成大量數據，因此識別其中的重要信息，并將其與生物體的生物特征進行關聯，進而用于了解和發現生物學規律，是代謝組學研究的重要步驟。代謝組學常用的多元統計分析包括無監督和有監督分析。主成分分析（principal component analysis，PCA）屬于無監督模式，可在樣本來源未知的情況下，通過提取擬合能力最大的幾個主成分，對原始數據進行降維處理。PCA通常在組學數據處理的早期階段進行，用于識別樣本大致分類情況并發現異常值［43］。偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）是有監督模式的一種，其在已知樣本分組的前提下，通過建立數學模型，達到提高樣本分類的目的，但是這種模式通常需要使用其它的驗證方法來檢驗模型是否出現過擬合情況［44］。在模型檢驗符合要求后，可進一步結合變量重要性投影（VIP）、S-plot等各種形式的載荷圖，用于繼續篩選在樣本分類中有重要貢獻的

差異代謝物。除上述方法外，支持向量機（SVM）和人工神經元網絡（ANN）等其它統計方法可進一步優化樣本分類并提高模型可信度，正逐漸被用于代謝組學分析中［45-46］。此外，單變量統計分析P值以及差異變化倍數（fold change，FC）也被進一步結合，用于尋找各實驗組間具有顯著性變化的代謝標志物。盡管大量統計軟件的出現為代謝組學的數據分析提供了便利，但這些軟件執行背后的算法知識仍需充分考慮，以確保篩選信息的完整性和準確性。

1.4 代謝標志物分析代謝標志物的分析是識別關鍵代謝物，準確解釋機體變化的關鍵步驟。主要包括代謝物的識別和生物解析。

1.4.1 代謝物鑒定代謝標志物的準確鑒定直接影響其潛在生物途徑的準確性。一些代謝數據庫的開發對于代謝物的識別和生物學機理的揭示具有十分重要的作用，具體包括HMDB、METLIN、MetaCyc、Golm Metabolome Database、Lipid Maps、LipidBank、MetaboLights和Metabolomics Workbench等含 豐富代謝物信息的生化數據庫以及PubChem、ChemSpider、NIST和MoNA等僅供物質鑒定的綜合數據庫［29］，具體網址見表2。這些數據庫大多含有大量代謝產物的MS/MS圖譜，部分數據庫還提供了不同儀器和碰撞能量下產生的碎片離子，研究人員可根據自身情況進行匹配。

表2 代謝組學研究中常用的代謝物鑒定數據庫Table 2.Databases for metabolite identification in metabolomics study

1.4.2 生物解析當代謝組學用于醫學研究時，代謝標志物一般用作疾病的早期診斷或闡明作用機制，為了初步判斷代謝物標志物診斷相關疾病的能力，通常需要繪制受試者工作特征曲線（ROC）進行評判，并以曲線下面積大于0.7作為具有準確診斷能力的標準［47］。同時代謝標志物的聚類熱圖可以將其在不同狀態下的濃度變化進行可視化，以進一步明確數據差異［20］。生物學意義的闡釋是代謝組學醫學研究的重點，為此需要將相關代謝標志物和代謝通路整合分析，HMDB、KEGG（https://www.kegg.jp/）以及MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）等在線數據庫的開發為建立它們的生物關聯和功能解釋提供了便利，被大量應用于代謝組學研究中［20］。除借助上述生化數據庫外，研究者還應不斷更新對代謝物生化功能的認識，以確保代謝組學結果的真實性。

2 細胞代謝組學的藥物研究進展

細胞代謝組學是通過細胞層面直觀認識生物事件的有力工具，尤其是檢測技術的不斷進步，為識別、量化和了解更多的細胞代謝物提供了可能。目前細胞代謝組學在藥物研究方面的應用涉及藥物研發、活性成分研究以及機制探究等多個方面。

2.1 藥物研發多數情況下，疾病會導致機體發生代謝變化，而代謝組學因可以更精確地分析表型差異并提供關于代謝物生化功能信息的特征，在識別疾病靶標，尋找針對性治療藥物方面具有重要作用。例如，Vastag等基于LC-MS技術對甲型流感（influenza A virus，IAV），1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type-1，HSV-1）人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染的細胞進行代謝組學分析，結果發現不同病毒的代謝變化具有特異性，其中乙酰神經氨酸和脫氧嘧啶可分別作為IAV和HSV-1的治療標志物，而HCMV感染的細胞代謝結果則表明檸檬酸和N-乙酰天冬氨酸等代謝物可作為病毒治療的潛在靶標，這為后續相關靶標藥物的開發利用提供了依據［48］。在腫瘤靶點發現上，細胞代謝組學的研究也在進行，如Liu等研究了小檗堿對胰腺癌（pancreatic cancer，PC）的治療能力，初步揭示了小檗堿可通過擾亂PC細胞的能量代謝，使得腫瘤細胞的生存和轉移能力顯著下降，進一步的靶向分析結果表明檸檬酸在整個能量代謝途徑中發揮著關鍵作用，可能成為藥物開發和針對PC治療的新靶點，值得深入研究［49］。陸苑等基于UHPLC QE Orbitrap-MS/MS細胞代謝組學技術，初步探究了銀杏黃酮苷元聯合阿霉素協同抗肝癌的作用及機制，結果表明兩者合用的協同抗腫瘤作用，可能與調控亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等多種代謝靶點，進而影響腫瘤細胞的能量供應有關，這為銀杏黃酮苷元在聯合抗腫瘤方面的進一步開發應用提供了可能［6］。而在對不同侵襲性腫瘤細胞系的研究中，Nomura等發現多類腫瘤細胞系中，單酰基甘油含量較低而游離脂肪酸的含量較高，這是由于此類細胞中單酰基甘油脂肪酶的活性較高造成，因此，單酰基甘油脂肪酶可能成為抗腫瘤靶標的新選擇［50-51］，后續可進行相關藥物的實驗研究。

2.2 藥物活性成分研究藥物活性成分研究對于明確藥物的作用機理，制定出合理的用量標準具有指導意義。尤其是中藥成分復雜，明確其發揮藥效的物質基礎，是提高中藥療效、穩定中藥質量、推動中藥現代化進程的重要手段。呂經緯等基于NMR細胞代謝組學結合分子對接技術篩選補腎壯骨湯促睪酮合成的活性成分，明確了櫻桃苷、原兒茶酸等14個化學成分可作為補腎壯骨湯促睪酮合成潛在活性成分，為此復方的藥效物質基礎研究提供了參考［52］。Feng等提出了一種基于靶向細胞代謝組學評價二至丸抗衰老效果并篩選有效提取物的新策略，指出石油醚提取物可能是二至丸抗衰老作用的潛在活性提取物，其作用途徑與三羧酸循環和糖酵解代謝相關，這與體外實驗結果一致［53］。Hao等結合細胞代謝組學和網絡藥理學技術，表明人參的免疫調節作用，可能與人參皂苷Re、人參皂苷Rg1以及山奈酚等活性成分對巨噬細胞的影響有關［54］。

2.3 藥物機制探究作用機制研究是理解藥物作用效應，從而更好地指導臨床合理用藥的重要環節，細胞代謝組學是在細胞水平上闡明藥物作用生化途徑的重要技術之一。梔子豉湯具有神經保護作用，Zhang等以GC-MS細胞代謝組學技術分析出谷氨酸、亮氨酸以及十八烷酸等多種代謝物，證明了梔子豉湯可通過恢復能量代謝，氨基酸代謝和脂質代謝等生物途徑，發揮抗氧化和抗凋亡的作用［55］。艾迪注射液和阿霉素聯合用藥是臨床腫瘤治療的方案之一，Wang等基于UHPLC-MS/MS平臺分析了兩者聯合抗肝癌的作用效果和機制，結果得出包括苯丙氨酸代謝、精氨酸生物合成、三羧酸循環和嘌呤代謝等7條生物途徑被顯著改變，證明了兩者聯合可通過平衡氨基酸和能量相關物質的代謝來發揮協同抗腫瘤作用［56］。Liao等建立了基于UPLC-QTOFMS的細胞代謝組學方法，揭示了紅景天苷治療缺氧損傷的機制可能與維持能量和脂質代謝的穩態有關［57］。Zhang等利用細胞代謝組學，研究了丹參對阿爾茨海默病的治療機制，結果表明丹參可能通過調控精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代謝、組氨酸代謝、泛酸和輔酶A生物合成、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成、檸檬酸鹽循環以及甘油磷脂代謝等生物途徑發揮治療作用，這為丹參在阿爾茨海默病疾病中的應用和進一步研究提供了理論依據［58］。

2.4 藥物安全性評價毒性研究對于保證藥物安全性至關重要，細胞代謝組學將細胞模型與系統生物學技術相結合，通過比較不同狀態下代謝標志物的變化，為藥物毒性研究提供了有利的支撐。Chaudhari等基于1H-NMR技術，對阿霉素誘導的心臟毒副作用進行分析，結果發現阿霉素可使正常細胞對丙酮酸和乙酸鹽的利用率降低并造成甲酸鹽的積累，進而導致能量產生不足和線粒體功能障礙，因此這些物質的變化可以用來評估阿霉素誘導的心臟毒性［59］。Wu等通過細胞代謝組學方法研究了伏立康唑治療真菌干擾時誘導的肝毒性機制，結果表明伏立康唑誘導的肝毒性與氧化應激有關，且在毒性檢測方面，由α-酮戊二酸、乙醇膽酸鹽和β-N-乙酰氨基葡萄糖組成的代謝物組合優于常規肝功能檢查［60］。Luo等使用HepG2細胞評估了梔子果的肝臟毒性，最終得出了與體內模型分析一致的結果，其中L-精氨酸、L-蛋氨酸、乙醇膽酸鹽、5，6-二氫尿嘧啶、黃嘌呤和胸苷因其在體內和體外肝損傷模型中均有顯著變化，可作為梔子果誘導肝損傷的首選生物標志物［61］。

綜上所述，細胞代謝組學等高通量測序技術的發展，為全面了解與生物系統相關的生物學信息提供了可能。除了上述應用外，細胞代謝組學的研究還涉及細胞培養條件的優化、營養學研究、干細胞重編程研究以及環境科學研究等更多領域［23］。

3 展望

總體而言，細胞代謝組學在研究細胞中低分子量代謝物，進而理解代謝物如何影響細胞行為和功能方面有著重要意義。但作為一門新興發展的科學，當前細胞代謝組學的應用仍面臨挑戰。首先，機體代謝物容易受到各種因素的影響，因此合理的實驗方案對于保證代謝譜的真實性至關重要，對于不同類別的細胞代謝組學而言，合適細胞系的選擇和標準化的細胞處理方案仍有待探索。其次，由于代謝物化學成分的異質性和現有分析儀器的特定局限性，全面代謝譜的獲得仍需以多種分析平臺的結合使用為前提。由于標準化合物不易獲得且缺乏標準的可通用代謝數據庫，生物標志物的識別鑒定也是代謝組學研究的難點之一，功能完善的代謝物數據庫仍有待開發。再者，低豐度代謝物的檢測和大量組學數據的正確分析是保證全面代謝譜，挖掘特異性生物標志物的前提，這對儀器的性能（如靈敏度和分辨率）和數據處理方法提出了更高的要求，值得關注。此外，細胞代謝組學和其它技術方法的有效整合（如與其它組學的整合以及體內動物模型的整合等）有助于理解復雜生物問題，也是需要研究的方向。總之，細胞代謝組學為生物學研究提供了非常有價值的信息，隨著技術的不斷完善和應用領域的不斷擴展，其前景必將十分廣闊。