銅過載介導骨骼肌萎縮的機制及治療新進展*

楊 威，李 暢，鄧云鋒，胡 昊，王 娟，范晶晶△

（1武漢體育學院運動醫學院，湖北武漢430079；2長沙衛生職業學院公共教學部，湖南長沙410100；3湖北省中醫院脊柱外科，湖北武漢430074）

銅是一種必需的微量元素，同時也是一種過渡金屬，具有氧化還原屬性，通過接受和轉移電子并以離子形式參與所有的生物學事件，對哺乳動物的能量代謝、活性氧去除、鐵吸收和信號轉導等生命過程至關重要［1］。銅的內穩態受肝臟代謝的嚴格調控，在糖尿病、肥胖、心力衰竭、神經退行性疾病、腫瘤等病理狀態下表現為含量顯著升高即銅過載；銅過載是細胞內銅代謝失衡而呈現出銅離子毒性的病理過程，是多種疾病干預的重要靶點［2-6］。作為人體內最大的氨基酸儲存庫，骨骼肌在動力輸出和姿勢維持上具有不可替代的決定作用，其關鍵組成部分肌蛋白和線粒體對外界刺激信號高度敏感，在多種病理狀態下銅過載和肌萎縮同步發生［7-12］，據此推測銅代謝異常可能與骨骼肌萎縮存在著某種機制關聯。目前，銅過載介導的骨骼肌萎縮的潛在機制尚不完全清楚，而多種用于降低機體銅離子水平的銅螯合藥理學技術有顯著發展，我們在此梳理并繪制了銅過載介導肌萎縮的相關機制圖譜，為臨床上運用銅螯合技術治療和緩解骨骼肌萎縮提供機制線索。

1 骨骼肌萎縮發生及機制

骨骼肌萎縮是多種慢性疾病如肥胖、糖尿病、心力衰竭、毒品成癮等的常見并發癥，病理學表現為肌肉的質量丟失和力量衰退，其發病機制復雜，可能與蛋白質代謝失衡、神經肌肉接頭失活、線粒體丟失等密切聯系［13］。肌萎縮不僅影響人類的正常步態和運動能力，嚴重威脅生活質量，還關聯著多種疾病的發生、進展及預后，決定著多種慢性疾病狀態下的死亡率［14］。目前的研究顯示，拮抗病理狀態下的骨骼肌萎縮是治療某些疾病本身的間接療法［15］。因此，探尋骨骼肌萎縮的新型干預靶點（如銅代謝）而有益于其治療顯得尤為重要。

骨骼肌是以氨基酸為基本組成單位、富含線粒體的運動器官，在正常成人中約占身體質量的40%，其質量維持是骨骼肌發揮代謝功能的物質基礎。骨骼肌可對外界病理刺激信號做出響應并形成萎縮表型，肌蛋白質和線粒體的穩態失衡是其發生萎縮的根本誘因［16］。正常生理狀態下，骨骼肌蛋白質處于不斷合成與降解的動態平衡中，同時線粒體通過不斷融合與分裂實現其質量控制，病理條件能夠打破相關的代謝平衡，誘導肌蛋白的降解多于合成、線粒體的分裂多于融合，即發生肌萎縮。這些代謝程序涉及到不同的調控機制，其中骨骼肌蛋白質合成主要依靠生長因子（如睪酮、生長激素、胰島素樣生長因子）介導的促合成信號，降解則主要依靠泛素-蛋白酶體、自噬、凋亡以及鈣蛋白酶的活動等降解途徑；線粒體的融合與分裂則是通過各自的上游靶點蛋白即線粒體融合蛋白和分裂蛋白的動態平衡來予以精確控制［17］。這些機制信號是骨骼肌萎縮治療藥物研發的關鍵理論基礎。

2 銅過載與骨骼肌萎縮

2.1 骨骼肌中銅的來源及作用銅是機體內多種必需酶的輔助因子，以離子形式參與細胞內所有的生化反應，對于維持器官的正常代謝至關重要，細胞內銅離子代謝穩態接受銅轉運體和伴侶蛋白的共同調控，其中轉運體基因7A型銅離子轉運ATP酶（copper-transporting ATPase 7A，ATP7A）和7B型銅離子轉運ATP酶（copper-transporting ATPase 7B，ATP7B）的突變會導致銅缺失和銅過載而誘發Menkes病和肝豆狀核變性（Wilson病）［18］。外源性銅是機體內銅的主要來源，主要通過食物獲取，這種蛋白結合型的食源性有機銅可經消化道細胞吸收至體內。銅代謝主要包含兩個代謝階段：第一階段，食源性銅在人體小腸部位吸收并進入血液與血清中的小分子如組氨酸、α2-巨球蛋白、白蛋白等相結合形成銅貯存池；第二階段，銅貯存池中的銅離子大部分經門靜脈入肝經過加工以銅藍蛋白的形式進入血液循環并轉運分配至全身的銅依賴器官［19］，包括大腦和骨骼肌，剩余部分的銅在血清中依然以與小分子相結合的形式存在。銅藍蛋白的降解通常也在肝臟中進行，肝內皮細胞可通過轉胞吞作用捕獲血清中的銅藍蛋白，導致其寡糖N端處的唾液酸殘基完整去除，脫唾液酸化的銅藍蛋白通過脫唾液酸糖蛋白受體的作用隨后被排入狄氏間隙并被肝細胞所內吞，通過肝細胞溶酶體的降解作用并釋放出銅離子；為了維持銅離子代謝平衡，多余的銅離子可通過肝臟外排進入膽汁并被膽汁酸鹽所固化并排出體外，這是銅外排的主要途徑［20］。

銅離子不僅對于成肌細胞的增殖和分化必不可少，對于分化后的肌細胞維持正常的代謝穩態也至關重要［21］。作為一種重要的靜態輔助因子，銅離子可利用自身的氧化還原屬性參與多種銅酶（如氧化還原酶、加氧酶、羥化酶、轉移酶等）的構建和形成，這些酶類可利用靈活的活化位點來最大化電子轉移和傳遞。最經典的銅酶是細胞色素C氧化酶（cytochrome C oxidase，CCO），作為電子傳遞鏈的終端酶，可通過細胞色素C的氧化和氧的還原來耦合電子傳遞，加強質子泵在線粒體膜上的穿梭促進ATP的生成［22］。伴隨著電子傳遞過程是氧化壓力的產生，肌細胞中抵御氧化壓力的重要銅酶是位于胞質中的Cu，Zn超氧化物歧化酶（Cu，Zn superoxide dismutase，SOD1），該酶可利用一個銅離子催化超氧化物的歧化反應，從而抑制氧化應激對細胞的損傷。銅離子在細胞中的另一個存在部位是銅分泌通路的相關機制途徑，如高爾基體反面網狀結構（trans-Golgi network，TGN）、內吞溶酶體、分泌顆粒和銅儲存囊泡，銅分泌通路使不同類型的細胞激活銅依賴性激酶執行不同的功能。此外，在某些銅依賴細胞中銅離子還可以調節激酶如Unc-51樣蛋白激酶1/2（Unc-51-like protein kinase 1/2，ULK1/2）、絲裂原活化蛋白激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase kinase 1，MEK1）和 磷 酸 二 酯 酶3B（phosphodiesterase 3B，PDE3B）的活性，從而影響自噬相關基因（autophagyrelated genes，ATGs）的表達、自噬體的形成、增殖和代謝活動［20］，其中某些激酶可能涉及到銅過載誘導的骨骼肌細胞萎縮相關信號通路［23］。

2.2 骨骼肌中銅離子代謝的調控骨骼肌是銅離子高度依賴且代謝旺盛的器官，同時也是銅的主要分布器官［24］。需銅性器官（包括骨骼肌）對銅離子的攝取遵循共同生理原則，由細胞內銅轉運體（copper transporter，CTR）和銅伴侶蛋白共同調控，其中銅轉運體（CTR1、CTR2和CTR3）負責銅離子的攝取，將經細胞膜上特定還原酶還原的銅離子跨膜轉運至胞內。另兩種銅轉運體ATP7A和ATP7B的表達具有組織差異性，除了肝細胞，在大多數細胞中ATP7A的表達比ATP7B要豐富［24］，兩者主要負責胞內銅離子的分布、儲存和排出。銅伴侶蛋白則可以與胞內銅離子相結合而抵消中和其毒性并將其傳遞給特定的靶蛋白，最重要的三種銅伴侶蛋白包括細胞色素C氧化酶17（cytochrome C oxidase 17，COX17）、抗氧化1銅伴侶（antioxidant 1 copper chaperone，ATOX1）和超氧化物歧化酶型銅伴侶（copper chaperone for superoxide dismutase，CCS），不同的銅伴侶蛋白在胞內介導不同的銅離子傳遞通路。

銅離子在骨骼肌中的代謝涉及銅轉運體和銅伴侶蛋白的調控，其中CTR1、ATP7A和ATP7B已被證明在骨骼肌細胞廣泛表達［25］。CTR1是最重要的銅攝入轉運蛋白，而CTR2的表達具有細胞特異性，可能更多地涉及到細胞內的銅離子轉運，但在肌細胞中的表達情況及其調節銅離子攝入的相關機制尚不清楚。人類的CTR1由190個氨基酸和含有特定的金屬連接序列的片斷組成，其中的蛋氨酸43和45區域是介導銅離子攝取的關鍵［26］，可通過內吞和離膜性位置遷移來調節膜上CTR1的表達和豐度調控細胞銅離子攝取，當胞內銅離子含量升高時，細胞會增強網格蛋白（clathrin）和發動蛋白（dynamin）依賴的內吞作用，降低細胞膜上CTR1的豐度，同時會向遠離膜邊緣的方向進行位置遷移，兩方面共同作用可抑制細胞對銅離子的捕獲和攝取［24］，避免銅過載對細胞的損傷，這種自動化感應機制可能是通過特異蛋白1（specificity protein 1，Sp1）作為中間物來介導完成的［27］。銅離子通過CTR1入胞后與其分離，隨后利用不同的銅伴侶蛋白介導多種銅離子傳遞途徑，其中COX17和非蛋白配體CuL對線粒體靶向的銅離子傳遞發揮紐帶作用。COX17通過還原其自身的半胱氨酸殘基與銅離子結合，將銅離子傳遞至線粒體膜間隙，并與兩種細胞色素C氧化酶合成蛋白（synthesis of cytochrome C oxidase proteins，SCO）——SCO1和SCO2相互作用參與CCO代謝途徑［28］；胞質中的CuL與銅離子結合后可穿過線粒體外膜進入膜間隙，用于CCO的裝配、SOD1的成熟及線粒體的進一步攝取和儲存［22］，兩者可共同調控線粒體的銅離子代謝平衡。此外，ATOX1可將銅離子傳遞至分泌途徑膜結構處的ATP7A和ATP7B的N端區域，增強銅離子分泌途徑的轉運活動，并調節銅離子在細胞內的分布［29］。CCS通過形成一種高度特異性的復合物將銅離子傳遞至SOD1，并在特異性位點完成金屬取代和雙硫鍵的形成，拮抗超氧化物對細胞的損傷［30］。細胞內銅離子的分布主要是通過ATP7A和ATP7B在胞內TGN、內吞體、黑色體等不同結構間的跨膜轉運，這一步驟對于銅酶的激活、銅離子的儲存及過量銅離子的排出至關重要，是細胞內銅穩態調控的關鍵［31］。

2.3 銅過載的可能機制細胞內的銅離子攝取和外流在相關蛋白包括Ctr1、ATP7A及ATP7B的調控作用下維持著精確的動態平衡，當銅離子攝取作用優于外流作用時，即可發生銅過載。銅過載是銅離子代謝發生機制障礙而呈現銅毒性的生物學事件，其涉及到多種人類疾病如神經退行性疾病、心血管疾病、癌癥等［32］。目前銅過載的準確調控機制尚不清晰，可能涉及到多種不同的信號通路及分子機制，是銅代謝生理學亟待解決的關鍵問題之一。衰老是銅過載發生的相關病理模型，為病理狀態下細胞內銅過載提供了機制線索［33］。正常生理狀態下，胞外銅過載會引起胞內銅穩態調控相關的應答機制反應：一方面網格蛋白和發動蛋白依賴的內吞作用增強，降低細胞膜上銅轉動體CTR1的豐度并使其向遠離膜邊緣的方向進行位置遷移，從而抑制細胞對銅離子的捕獲和攝取，減少銅離子的入胞效應，另一方面，銅轉運體ATP7A及ATP7B會加強對銅離子的排出代謝活動，兩者共同作用維持細胞內的銅穩態，避免銅過載的發生［24］。多種慢病狀態下可見循環性銅藍蛋白的顯著增加，從而對骨骼肌細胞形成胞外銅過載，病理狀態可能通過破壞上述銅穩態維持機制導致銅離子攝取和排出代謝障礙，進而誘發胞內銅過載，氧化還原失衡和自噬功能障礙可能涉及到這一途徑［33］。由此可見，銅過載不是單一因素的調控結果，而是多種信號級聯事件的共同作用產生的，深入探究并闡明相關分子機制是銅代謝生理下一步的研究方向。

2.4 銅過載在肌肉萎縮中的作用及相關信號機制銅離子不僅參與銅蛋白的構建，還可參與機體內糖、脂代謝的調控。銅缺乏時胰島素分泌抑制和糖耐量受損揭示了銅在糖穩態維持中的關鍵性角色［34］，作為一種內源性的脂肪分解調節器，銅離子可直接結合PDE3B的半胱氨酸位點并導致其活性抑制，進而通過環腺苷酸依賴的途徑促進脂解效應［35］。

此外，銅離子參與介導糖與脂肪代謝，高糖環境可顯著增強銅藍蛋白對低密度脂蛋白的氧化作用［36］。骨骼肌是糖類和脂肪代謝的關鍵器官，骨骼肌萎縮的發生往往伴隨著能量代謝障礙［37］，銅離子在其中的調控作用值得關注。

2.4.1 銅過載通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激 酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路抑制骨骼肌蛋白合成PI3K/Akt/mTOR是主導肌蛋白合成的關鍵信號通路，其信號轉導過程如下：在生長因子的作用下，PI3K可磷酸化肌細胞膜上的二磷酸脂酰肌醇，從而形成三磷酸磷脂酰肌醇，進一步引起下游靶點Akt的磷酸化激活。Akt的激活可通過兩條不同的信號通路誘導肌蛋白合成：一方面可以通過mTOR非依賴性方式直接抑制糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）并活化真核起始因子2B（eukaryotic initiation factor 2B，eIF2B），從而促進肌蛋白質合成；另一方面，Akt還可磷酸化激活主要由mTOR復合物1（mTOR complex 1，mTORC1）和mTORC2構成的下游靶點mTOR，其中mTORC1具有雷帕霉素敏感性，可磷酸化并活化p70 S6激酶，從而促進核糖體S6蛋白的高能磷酸化并最終誘導mRNA的轉錄和翻譯，促進肌蛋白質合成；此外，活化的mTORC1還可磷酸化eIF4E結合蛋白1并抑制其活性，同樣可促進mRNA翻譯并增加肌蛋白質合成［38］。銅過載可顯著抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路進而削弱骨骼肌的蛋白合成，這種效應可能是通過氧化應激標志物活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）來介導的。銅過載是ROS的強力誘導因子，ROS可直接激活NF-κB來促進肌肉生長抑制素myostatin的高表達，myostatin可通過某種未知機制抑制miR-486的表達，從而激活磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的活性，進一步抑制Akt的募集與磷酸化［39］。因此，ROS可通過myostatin的介導作用形成miR-486/PTEN/PI3K/Akt信號級聯而抑制肌蛋白合成，這是銅過載誘導骨骼肌萎縮的可能機制之一。

2.4.2 銅過載擾亂骨骼肌線粒體穩態線粒體是一種銅依賴性細胞器，每個線粒體大約含有45 000～50 000個銅離子，線粒體需要銅離子維持CCO和膜間隙中SOD1的正常代謝功能。銅離子主要分布于線粒體的膜間隙和基質中，前者中的銅離子主要依靠銅伴侶蛋白COX17、CCS和替代性配體谷胱甘肽（glutathione，GSH）、非蛋白配體CuL對胞質中銅離子的捕獲及轉運，后者中的銅離子則僅來源于CuL，其在胞質中結合的銅離子可穿越膜間隙通過位于線粒體內膜上的特定銅轉運受體SLC25A3的介導進入基質而儲存，在銅離子缺乏時轉運釋放至膜間隙和胞質中進行循環代謝［22］，但線粒體內膜上介導銅離子從基質轉出至膜間隙的銅轉運受體目前尚不明確。銅穩態對于骨骼肌線粒體維持正常的融合與分裂代謝至關重要，銅離子參與CCO的電子傳遞活動及線粒體的氧化磷酸化生成ATP的程序［40］，病理狀態可引起線粒體總量、數目和功能的重塑與改變，間接影響肌肉的力量輸出和質量維持，銅過載在其中的調控作用值得關注。

線粒體依賴自身不斷進行的融合與分裂以應對生理環境的改變和病理環境的刺激，融合與分裂的動態平衡可形成利于ATP生成的最佳線粒體功能網絡［41］。融合是指不同線粒體在融合蛋白的作用下產生連接從而引起其內容物包括代謝物、蛋白、mtDNA的混合和重新分配，其主要接受線粒體融合蛋白1/2（mitofusin 1/2，MFN1/2）及視神經萎縮蛋白1/2（optical atrophy 1/2，OPA1/2）的調控，融合時兩側反應的線粒體膜是相同的，屬于同源融合，其中MFN1/2主導外膜融合而OPA1/2主導內膜融合［42］，MFN1/2的抑制足以誘導線粒體缺失性mtDNA堆集和肌肉萎縮［43］，由此可見，線粒體融合對于骨骼肌質量維持至關重要，融合缺陷是骨骼肌萎縮的重要誘因；分裂是指線粒體在分裂蛋白的作用下將不可逆損傷或不必要部分進行網格化隔離，以便于通過自噬-溶酶體途徑進行降解和清除［44］，其主要通過細胞質中的發動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）與位于線粒體外膜上的對應受體包括線粒體裂變因子1（mitochondrial fission factor 1，MFF1）、裂變蛋白1（fission protein 1，FIS1）、49/51 kD線粒體動力蛋白（mitochondrial dynamics proteins of 49/51 kD，MiD49/51）的結合并觸發相關信號級聯來完成。線粒體分裂狀態與骨骼肌質量密切聯系，裂變的過度激活也會產生蛋白過度分解、線粒體功能缺陷和肌萎縮表型［45］。

融合與分裂失衡是異常線粒體產生的主要來源，同時也是骨骼肌萎縮的前體誘因。銅過載擾亂線粒體質量控制是通過兩方面的途徑實現的：一方面，銅過載可通過ROS的介導顯著上調骨骼肌中DRP1 mRNA和蛋白表達水平并抑制MFN1/2及OPA1的表達，同時引起線粒體形態異常［46］；另外，銅離子是MEK1/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號的激動劑，活化的ERK可通過調節MFN1的寡聚化而抑制線粒體融合并促進分裂［38］。這些證據提示銅過載可削弱線粒體融合并加劇分裂，同時可引起線粒體結構異常和功能缺陷，是肌肉萎縮的可能機理。

2.4.3 銅過載通過ULK1/2介導骨骼肌自噬程序的過度激活自噬是指細胞將自己細胞質的一部分（如線粒體和毒性蛋白）包裹起來形成自體吞噬泡，進而被轉移至溶酶體依靠水解酶將其分解成氨基酸等代謝產物。適度的細胞自噬有助于骨骼肌蛋白和線粒體的更新和穩態維持，自噬過度激活則會誘導肌肉丟失萎縮［47］。ULK1/2是高度保守的絲/蘇氨酸激酶活性的蛋白，ULK1/2蛋白激酶、200 kD的黏著斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD，FIP200）、ATG13和ATG101構成的Atg1復合物是哺乳動物細胞自噬的啟動子，可通過激活自噬相關蛋白泛素樣結合系統來促進自噬體雙膜結構的形成和延展，ULK1/2的第180位蘇氨酸磷酸化及去磷酸化是這一細胞程序發生的關鍵［20］，銅過載在誘導自噬程序中扮演著重要角色，這一途徑可能涉及到直接和間接兩種機制：一方面，銅離子是ULK1/2激酶的重要調控因子，ULK1/2上含有銅共價結合的氨基酸殘基序列并可直接與銅離子連接，ULK1/2銅連接位點的突變會使其失活并喪失對下游底物ATG13的激活能力，同時銅螯合處理或廢除銅離子和ULK1/2的相互作用會導致自噬抑制，這些結果表明銅過載可直接激活ULK1而加劇自噬活動；另一方面，氨基酸和能量狀態是ULK1/2的重要上游調控因子，可分別通過mTORC1和AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）來調控ULK1/2介導的自噬活動，銅過載可顯著抑制骨骼肌細胞的Akt/mTORC1并伴有自噬相關基因下游底物beclin-1的磷酸化及自噬激活［48］。上述證據確認了ULK1/2在銅過載激活細胞自噬而誘導骨骼肌丟失中的關鍵性角色，可此研究基礎上以肌細胞為模型的進行進一步的實驗驗證。

2.4.4 銅過載促進細胞凋亡參與肌肉萎縮細胞凋亡是一種程序性的細胞死亡過程，受調節蛋白、內切酶、蛋白酶抑制劑和半胱天冬酶caspase的共同調控并引起下游信號轉導，形成凋亡小體，導致細胞發生非炎癥性自我毀滅［49］。細胞死亡刺激時，啟動型caspase（即caspase-8、-9和-12）被動員和活化，激活執行型caspase（即caspase-3、-6和-7）并誘發細胞降解和DNA碎片化。根據刺激信號的來源可區分為外源性凋亡和內源性凋亡，外源性凋亡是由細胞表面死亡受體（如腫瘤壞死因子受體）與其配體（如腫瘤壞死因子α）的相互作用觸發的，內源性凋亡涉及線粒體或內質網的參與，其主要誘導因子包括DNA損傷、缺氧和代謝應激。值得注意的是，線粒體可以通過不依賴caspase的激活，即釋放凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）和內切酶G對DNA進行切割和碎片化誘導凋亡發生［50］。在骨骼肌中，由于肌細胞的多核特性，凋亡級聯信號的激活會導致單個肌核和部分肌漿的清除，這一過程被稱為肌核凋亡，肌核凋亡不會導致細胞死亡但會誘導肌纖維萎縮。此外，研究顯示凋亡信號還可能通過激活泛素-蛋白酶體系統觸發肌蛋白降解程序，誘導肌纖維萎縮［51］。事實上，肌肉萎縮時通常伴隨著凋亡和蛋白質降解的同步發生。骨骼肌肌纖維的另一個特點在于存在兩個在生物能量和結構上截然不同的線粒體亞群：位于肌膜下的線粒體和肌纖維中的線粒體。這兩個亞群對凋亡刺激呈現出不同的易感性，因此可能分別參與了骨骼肌萎縮的不同發病機制［52］。

銅過載與凋亡發生的相關研究尚不多見，人類細胞模型顯示，高劑量的銅離子處理會誘發核仁磷酸蛋白和纖維原蛋白在核質中的異常分布，損害核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）的加工處理，觀察到來自A2位點切割的異常34S rRNA增加，下游的pre-rRNA減少，60S亞基的積累不足，進一步的轉錄組分析顯示銅過載還可擾亂核糖體生物合成相關基因的表達，最終通過誘導核仁壓力和p53非依賴性途徑來促使細胞凋亡［53］。在骨骼肌樣本中，銅過載不僅可直接促使肌溶解，還可通過同時激活啟動型caspase-12、執行型caspase-3及多種內質網壓力相關蛋白的表達等途徑來增加內網質壓力而誘發細胞凋亡［54］，據此推測銅過載引起的肌纖維降解丟失可能主要是通過內源性凋亡途徑實現的，外源性凋亡、肌核凋亡、線粒體亞群的差異性紊亂是否參與這一病理程序尚需進一步的實驗驗證。

2.4.5 銅死亡（cuproptosis）在肌肉萎縮中的可能作用銅死亡是一種不同于凋亡、焦亡、壞死及鐵死亡的新型細胞死亡形式［55］，是繼鐵死亡（ferroptosis）之后又一金屬離子相關的死亡途徑。缺氧可抑制銅離子載體誘導的細胞死亡，這一效應可被低氧誘導因子脯氨酰羥化酶抑制劑所阻斷，同時糖酵解條件下細胞呈現對銅離子殺傷作用的抵抗，這些證據表明細胞呼吸是介導銅死亡發生的關鍵，對銅離子暴露的ABC1細胞代謝物進行分析后觀察到多種與三羧酸循環相關的代謝途徑紊亂，而對銅離子呈現抗性的A549細胞則無變化，暗示銅死亡與線粒體代謝之間的密切關聯。采用全基因組成簇的規律性間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）技術分析發現鐵氧化還原蛋白1（ferredoxin 1，FDX1）和蛋白質脂酰化是銅過載誘導細胞死亡的關鍵調控因子，FDX1負責編碼的一種還原酶可將二價銅離子還原為更具毒性的一價銅離子，蛋白質脂酰化主要發生在調節三羧酸循環的四種酶上，是一種高度保守的賴氨酸翻譯后修飾。同時，鑒于FDX1基因敲除可通過抑制丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的三羧酸循環而導致蛋白質脂酰化完全喪失，表明FDX1是蛋白質脂酰化的上游調控因子。進一步的研究顯示，銅離子可直接結合并誘導脂酰化的二氫硫辛酸轉乙酰基酶的寡聚化，同時導致鐵硫簇蛋白的失衡觸發蛋白毒性應激。總之，銅死亡主要是通過銅離子與三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）的脂酰化成分直接結合而發生，這可促使脂酰化蛋白聚集和鐵硫簇蛋白丟失，從而誘發蛋白質毒性應激并導致細胞死亡［56］。目前對于銅過載狀態下骨骼肌細胞的銅死亡機制尚不清晰，根據現有的研究證據，銅過載介導肌萎縮的可能機制如圖1所示。

Figure 1.The mechanism pathways of copper overload-mediated skeletal muscle atrophy.ROS：reactive oxygen species；PTEN：phosphatase and tensin homolog；PI3K：phosphatidylinositol 3-kinase；Akt：protein kinase B；mTORC1：mammalian target of rapamycin complex 1；GSK3β：glycogen synthase kinase 3β；eIF2B：eukaryotic initiation factor 2B；eIF4EBP1：eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1；p70S6K：70 kD ribosomal protein S6 kinase；Drp1：dynamin-related protein 1；MFN1/2：mitofusin 1/2；OPA1：optical atrophy 1；FDX1：ferredoxin 1；TCA：tricarboxylic acid cycle；ULK1/2：Unc-51-like protein kinase 1/2.圖1銅過載介導肌萎縮的機制通路

3 降銅治療方案

上述研究表明，銅過載與肌萎縮具有內在機制上關聯性，推測利用銅螯合降銅離子水平可能是延緩肌萎縮的有效手段。Wilson病是銅過載的經典病理模型，銅螯合及其替代性方案對于其臨床治療具有顯著意義［57］。銅螯合劑通常是一類具有特殊結構的化合物，其能夠特異地結合銅離子并形成穩定的復雜環狀結構。銅螯合劑調控機體內過高的銅水平涉及不同的機制，其中青霉胺、曲恩汀和二巰基琥珀酸可通過與銅離子形成復合物并隨尿液排出，而四硫鉬酸鹽則是促進膽道銅離子的排泄實現降銅效應。此外，鋅作為人體所必需的另一種微量元素，可通過誘導金屬硫蛋白的高表達進而緊密連結銅離子并被腸上皮細胞捕獲，最終通過芽脫落的形式促進銅離子的清除［58］，作為銅離子的有效螯合劑，補充鋅劑是實現降銅效果的一種輔助替代方案。

低銅飲食是降銅治療的重要方法，銅在不同類型食物中的豐度具有廣譜差異性，通常在動物肝臟、貝類水產、豆類、堅果及奶酪中含量較高［59］。鑒于銅超載在肌萎縮中的可能角色，制定健康科學食譜，避免攝入高銅食物對于防止肌肉萎縮是必要的。銅螯合劑由于其特殊的生物化學性質導致其具有一定的細胞毒性而呈現出不同的副作用［60-61］。目前尚未檢測到天然的銅螯合劑，但多種可食用性天然化合物顯示出拮抗銅過載的巨大潛力：在黑腹果蠅模型中，姜黃素對銅離子過載誘導的氧化壓力和線粒體凋亡具有抑制效應［62］；火龍果提取物能夠改善秀麗桿線蟲和斑馬魚模型中的抗氧化系統，削弱銅過載狀態下的細胞死亡和脂質過氧化［63-64］。這些證據揭示某些天然化合物作為食物補充物在預防銅氧化損傷，修復臨床銅中毒中具有潛在的應用前景和常用價值，尋找綠色天然的降銅物質改善肌萎縮是食品科學研究領域未來的努力方向。

4 總結與展望

越來越多研究觀察到體內銅離子代謝異常會導致一系列疾病的發生發展，包括肥胖癥、神經退行性疾病、心血管疾病、腫瘤等［65］，銅過載參與肌萎縮的相關機制逐漸引起關注。肝臟是外源性銅攝取及內源性銅離子穩態調控的關鍵器官，糖尿病、心力衰竭、癌癥狀態時的能量代謝障礙通常伴隨著肝臟應激代償并主要以銅藍蛋白的形式形成胞外銅超載，當細胞內銅離子穩態調控的關鍵靶點蛋白CTR1、ATP7A、ATP7B不足以代謝過多的銅離子時會形成胞內銅過載并觸發相關的病理程序。本文首次結合相關研究證據，對銅過載誘導肌萎縮的信號通路及可能機制進行了系統歸納闡述（圖1）。鑒于骨骼肌是哺乳類動物最大的氨基酸儲存庫，顯示銅離子作為中間介導物調節機體能量障礙時的氨基酸代謝、通過其自身穩態調控充當能量傳感器的新穎角色，此外，骨骼肌作為一種內分泌和解毒器官，可通過分泌多種肌細胞因子如成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，FGF-21）、鳶尾素（irisin）、肌肉素（musclin）及Apelin肽，同時在運動時通過促進有毒的犬尿氨酸轉化為抗氧化的犬尿酸參與肝臟的能量代謝和相關病理調控［66-69］，由此可見，深化銅生理研究對于建立和推動“肝-肌軸”理論學說具有重要學術價值（圖2）。

Figure 2.The metabolism mechanism of copper overload-mediated liver-brain axis.FGF21：fibroblast growth factor 21；CTR1：copper transporter 1；ATP7A/7B：copper-transporting ATPase 7A/7B；KYN：kynurenine；KYNA：kynurenic acid；KAT：kynurenine aminotransferases.圖2銅過載介導的肝-腦軸代謝機制圖

事實上，銅過載作為氧化應激ROS的強力誘導因子，與骨骼肌蛋白質代謝紊亂和線粒體功能失調的相關機制緊密相連：一方面，ROS可激活肌肉萎縮盒F基因（muscle atrophy F-box，MAFbx）和肌肉環狀指基因1（muscle ring finger 1，MuRF l）參與的泛素蛋白酶體和Ca2+依賴的蛋白酶體的活性，加劇骨骼肌蛋白質丟失；另一方面，ROS可通過抑制沉默信息調節子（silent information regulator 1，SIRT1）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）信號通路而降低線粒體的生物合成，并通過觸發線粒體DNA損傷、電子轉移鏈和膜電位的異常等途徑加劇線粒體的降解、丟失［70］，其與銅過載誘導的骨骼肌萎縮的機制關聯性有待進一步研究。

本文首次關注銅過載在肌萎縮中的作用，為銅螯合改善肌萎縮提供了機制基礎。基于以上理論，采用銅螯合劑可能是治療和改善多種病理狀態下肌萎縮的一種潛力療法，具體療效尚需進一步的臨床驗證。