中性粒細胞外誘捕網在腫瘤微環境中的作用研究進展

馬雪妮，許慧梅，張德奎

蘭州大學第二醫院消化內科，蘭州 730030

腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)是腫瘤生長所必需的微環境[1]，包括細胞成分與非細胞成分。細胞成分包括間充質細胞、免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞、周細胞及脂肪細胞等，非細胞成分包括細胞外基質、基質金屬蛋白酶(MMPs)、細胞因子及趨化因子等。其中免疫細胞、間充質細胞及內皮細胞可分泌多種細胞因子直接作用于腫瘤細胞，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，它們相互調控，共同形成抑制性免疫分子網絡，使腫瘤細胞能夠躲避機體免疫系統的攻擊，實現免疫逃逸[2-3]。

中性粒細胞是人外周血中最豐富的白細胞，約占白細胞總數的50%～70%，在先天性免疫系統中扮演著重要角色[4]，可通過吞噬作用、脫顆粒、產生活性氧等多種途徑抵御外界病原體的入侵，是機體應對病原體入侵的第一道防線[5]。除此以外，中性粒細胞還可形成有別于細胞壞死及凋亡的特殊細胞死亡程序——中性粒細胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)，參與機體的各種病理生理過程[6]。

近年來研究發現，中性粒細胞產生及釋放NETs的過程不僅發生在敗血癥等感染性疾病中，而且在非感染性疾病如系統性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕關節炎(RA)、糖尿病、動脈粥樣硬化、急性肺損傷、肝缺血再灌注損傷、血栓形成及慢性肝病中也發揮著關鍵作用[7-8]。此外，NETs在多種腫瘤中高表達，如肺癌[9-11]、肝癌[11]、淋巴瘤[12]、結直腸癌[13]、乳腺癌[10,14]、胃癌[15]等，并與腫瘤的發生、發展、轉移及其相關的血栓形成密切相關。本文就TME對NETs表達的影響，以及NETs在TME中的作用進行綜述，旨在探討NETs作為腫瘤標志物及潛在治療靶點的臨床應用前景。

1 TME對NETs形成的影響

1996年，Takei等[6]在使用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)刺激中性粒細胞時，觀察到一種不同于細胞凋亡(核固縮、細胞質空泡化)及細胞壞死(保持核膜完整性)的現象，即中性粒細胞的分葉核退縮、擴散，繼而核膜破裂，核內成分釋放到細胞質，細胞膜破裂[6]。直到2004年，Brinkmann等[16]將該過程中釋放到胞外的纖維網狀結構正式命名為NETs。NETs是以DNA為骨架并鑲嵌多種活性蛋白的細胞外網狀結構，其中的活性蛋白包括中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)及組織蛋白酶G(cathepsin G，CG)等，而染色質是網狀結構的主干[17]。研究發現，多種物質均可刺激中性粒細胞產生NETs，包括細菌、真菌、原生動物、病毒等在內的病原體以及一些化學或生物因素[5,9-13]。

白細胞介素(IL)-8是CXC家族的典型趨化因子，又稱CX-CL8，負責中性粒細胞向炎癥部位的募集并活化[18]。研究發現，來自彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)的IL-8與中性粒細胞上的受體(CXCR2)相互作用，通過激活Src、p38及ERK信號通路形成NETs[12]。同時，Alfaro等[19]發現，在前列腺癌及非小細胞肺癌中，腫瘤細胞產生的包括IL-8在內的趨化因子能夠募集骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)，使其形成NETs，該過程能夠募集更多的中性粒細胞，有助于腫瘤細胞的免疫逃避。最近有研究顯示，黑色素瘤及胰腺癌中的腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)產生的淀粉樣蛋白β能夠刺激NETs的形成，稱為腫瘤相關NETs(t-NETs)，此過程依賴于活性氧(ROS)的產生[20]。因此，TME能夠刺激NETs的產生，從而促進NETs形成(NETosis)。

2 NETs對TME的影響

2.1 對腫瘤細胞的影響 NETs能夠促進腫瘤細胞的增殖。Miller-Ocuin等[21]研究發現，來源于NETs的細胞外DNA可通過激活胰腺星狀細胞促進腫瘤細胞增殖，而通過肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)抑制劑或脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)抑制NETs的生成能夠逆轉上述作用；且這種促腫瘤細胞增殖的機制還可能涉及NETs的多種活性蛋白酶。Yazdani等[22]研究發現，結直腸癌細胞受到外界刺激后會釋放損傷相關分子模式(DAMP)蛋白，在此過程中將中性粒細胞募集到TME，并誘導NETs的形成，而NETs主要通過增加線粒體的生物合成來增加能量的產生，并促進腫瘤細胞的增殖。NETs通過釋放NE激活TLR4-p38-PGC-1α軸，從而促進線粒體生物合成及腫瘤生長。在PAD4-/-小鼠體內，通過DNase Ⅰ或NE抑制劑(NEi)抑制NETs的形成，或在體外阻斷NE-TLR4-PGC-1α軸，都可以抑制線粒體的生物合成并減緩腫瘤的生長。此外，DLBCL產生的NETs可直接上調DLBCL Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)途徑，隨后激活核因子(NF)-кB、STAT3及p38途徑，從而促進腫瘤進展。動物實驗研究發現，抑制NETs形成、阻斷IL8-CXCR2軸或抑制TLR9均會抑制腫瘤的進展[12]。

NETs可促進腫瘤細胞的轉移。Martins-Cardoso等[14]發現，NETs能夠將人乳腺癌細胞MCF7(主要為CD44Lo/–CD24+表型)轉化為CD44+CD24Lo/–表型，而CD44是一種細胞表面糖蛋白受體，可識別多種配體，包括細胞外基質成分如透明質酸、骨橋蛋白、金屬蛋白酶等，與腫瘤遷移及轉移有關[23]。將NETs與人乳腺癌細胞MCF7共培養發現，NETs能將MCF7典型的上皮形態轉變為間充質表型，即N-鈣黏蛋白及纖連蛋白的表達增加，而E-鈣黏蛋白的表達被抑制，從而導致MCF7細胞的遷移能力增強。還有研究證實，在小鼠結腸癌及肺癌模型中，即便不存在敗血癥，NETs仍可捕獲循環中的腫瘤細胞，使其黏附于肝臟[24]。而Najmeh等[25]研究發現，在肺腺癌細胞中，這種黏附作用是整合素介導的蛋白-蛋白互相作用；在NETs及腫瘤細胞中，β1整合素均呈高表達，且兩種β1整合素均參與了這種黏附作用；而將NETs上的β1整合素阻斷后，腫瘤細胞與NETs黏附減少，當腫瘤來源的β1整合素被抑制后，來源于NETs的β1整合素也會相應減少，由此可以推論來源于NETs與來源于腫瘤細胞的β1整合素可能存在某種共域化作用。此外，跨膜蛋白CCDC25是一種存在于腫瘤細胞表面的NETs DNA受體，可通過激活ILK-β-parvin信號通路增強腫瘤細胞的活性，從而促進腫瘤的轉移[26]。

2.2 對免疫細胞的影響 TME中浸潤的免疫抑制性細胞是腫瘤抑制性免疫微環境形成的關鍵因素，這些免疫抑制性細胞包括腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)、MDSCs、調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)等，它們能夠協助腫瘤進行免疫逃逸，促進腫瘤的發生發展[27]。研究發現，腫瘤細胞產生的趨化因子可促進中性粒細胞及MDSCs發生NETosis，在此過程中，NETs將腫瘤細胞包裹起來，阻斷了免疫細胞與周圍靶細胞的結合，從而使腫瘤細胞免受CD8+T細胞及自然殺傷(NK)細胞介導的細胞毒性作用，而PAD4抑制劑可抑制腫瘤的轉移，是腫瘤免疫治療的基礎[13]。Xia等[28]發現，表達DNase Ⅰ的腺病毒(即AAV-DNaseⅠ)可通過抑制中性粒細胞募集、抑制NETs形成、增加CD8+T細胞數量、減少CD4+T細胞數量來調節TME中的先天性及獲得性免疫應答，而CD8+T細胞是抗原特異性抗腫瘤免疫的主要效應器，可以識別并殺死腫瘤細胞。此外，有研究發現，腫瘤細胞通過募集中性粒細胞使其分泌CCL17而將Tregs募集到腫瘤部位，此過程損害了免疫系統對腫瘤的殺傷能力[29]。因此，NETs可能通過作用于TME中的免疫細胞協助腫瘤進行免疫逃逸，從而促進腫瘤的發生發展。

2.3 對內皮細胞的影響 NETs中的多種成分可通過影響內皮細胞而促進腫瘤微血管的生成。Jung等[30]發現，組蛋白作為NETs的重要組成部分，能在胰腺癌中促進內皮細胞小管形成，而組蛋白的抑制劑(如肝素或多聚唾液酸)可逆轉以上作用。此外，NE能通過誘導TME內的血管生成促進腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲，其可能的機制是NE導致腫瘤抑制因子失活，從而促進TME中的血管生成[31]。Wilson等[32]認為CG不僅具有降解細胞外基質的功能，還可通過刺激血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)而促進新生血管形成，使轉移灶擁有豐富的血供，從而繼續生長；對骨髓轉移癌小鼠模型使用CG抑制劑，可使其微血管密度低于正常對照。另外，有研究顯示，結直腸癌患者腫瘤細胞產生的NETs能夠促進人臍靜脈內皮細胞轉化為促凝表型，即表現為磷脂酰絲氨酸(PS)外露增加、凝血時間縮短、大量纖維蛋白形成，從而促進腫瘤相關血栓形成[33]。

2.4 對腫瘤相關成纖維細胞的影響 腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)是TME中活化的成纖維細胞，可分泌多種細胞因子，在腫瘤的發生發展中發揮著重要作用[34]。Takesue等[35]通過體內及體外實驗證實，NETs可作用于胰腺導管腺癌中的CAFs，從而促進肝轉移，而NETs抑制劑可減少腫瘤組織中CAFs的募集，進而抑制肝轉移。Munir等[20]進一步研究發現，在黑色素瘤及胰腺癌中，這種作用是CAFs產生的淀粉樣蛋白β介導的，抑制NETs或淀粉樣蛋白β均能抑制腫瘤的生長，并恢復中性粒細胞的抗腫瘤活性。

2.5 對細胞外基質及細胞因子的影響 NETs還可通過調控TME中的細胞外基質及細胞因子而影響腫瘤的進展。一方面，Albrengues等[11]發現，持續的肺部炎癥會導致在休眠癌細胞周圍形成NETs，作為NETs的重要組成部分，NE及MMP9依次作用于細胞外基質中的層黏連蛋白-111，使其暴露出一個新的表位，該表位能與腫瘤細胞表面的整合素α3β1結合，從而使休眠的腫瘤細胞蘇醒，進一步促進腫瘤的復發與轉移。另一方面，在胰腺癌中，胰腺癌細胞可產生IL-17，后者通過募集中性粒細胞誘導NETs的產生；抑制IL-17可增強免疫檢查點抑制劑(如PD-1、CTLA4)的敏感性，而抑制中性粒細胞或PAD4依賴的NETosis能產生類似的效應[36]。

3 NETs的臨床應用前景

3.1 作為腫瘤標志物的臨床應用前景 NETs可作為多種腫瘤的標志物，與腫瘤的分期、分型密切相關。Rayes等[24]研究發現，NETs水平在肺癌、胃癌及食管癌患者中明顯升高，晚期患者明顯高于早期患者，且僅有腫瘤也可誘導NETosis，不依賴于手術應激及炎癥反應。Zhang等[15]發現，外周血NETs水平在以下人群中從高到低依次為：胃腺癌晚期患者、胃腺癌術前患者、胃腺癌術后患者、胃良性病變患者、健康志愿者；且NETs水平與腫瘤的分型及預后相關。Park等[10]在人乳腺癌組織標本中檢測到NETs，其中三陰性乳腺癌中表達量最高，Luminal型乳腺癌中表達量很少，甚至不表達。還有研究發現，NETs廣泛存在于乳腺癌及結腸癌患者的肝轉移病灶中，而跨膜蛋白CCDC25作為存在于腫瘤細胞表面的NETs DNA受體，可增強腫瘤細胞的活性，促進腫瘤的轉移[26]。血清中NETs的水平及腫瘤細胞表面CCDC25的表達量可作為生物標志物，特異性地預測早期乳腺癌患者肝轉移的風險。因此，NETs作為生物標志物在腫瘤的分期、分型及預測腫瘤進展和預后方面將發揮重要的作用。

3.2作為腫瘤治療靶點的臨床應用前景 雖然目前尚無臨床試驗評估靶向NETs對于腫瘤發生、發展、轉移及復發的影響，但已有研究提示抑制NETs對腫瘤的早期防治具有重要意義。van der Windt等[37]發現，抑制NETs可使非酒精性脂肪肝誘發的肝癌發生率降低50%。同樣地，使用NE抑制劑可以明顯抑制NETs形成，阻止腫瘤細胞與肝毛細血管竇及肺毛細血管網內皮細胞的黏附，進而減少腫瘤細胞向肝臟與肺部轉移[27]。另外，DNase Ⅰ或PAD4抑制劑可抑制NETs的形成，進一步抑制腫瘤的發生發展[9-13,28]，且PAD4抑制劑或DNase Ⅰ也可減輕NETs介導的腫瘤相關腎功能損傷[38]。目前，NE抑制劑及DNase Ⅰ已用于其他呼吸系統疾病的治療[39]。以上研究提示，NETs作為腫瘤治療的靶點可能會有很好的應用前景，當然，考慮到不同腫瘤的特異性、不同治療方式的影響及腫瘤患者與動物模型的差異，將NETs抑制劑真正應用于臨床還須謹慎。

4 總結與展望

中性粒細胞一直以來被認為是人體重要的防御機制，可通過NETs誘捕并殺滅有害病原體。目前研究發現，NETs在多種腫瘤中高表達，TME中的成分能夠刺激NETs的形成，而NETs也能通過影響TME中的腫瘤細胞、免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞及細胞外基質等促進腫瘤增殖、侵襲及轉移。以上研究結果提示，NETs作為預測腫瘤進展及預后的標志物，以及潛在治療靶點將有很好的應用前景。但由于受到腫瘤類型、治療方式及腫瘤患者與動物模型差異的影響，具體的作用機制還需進一步探討。