胭脂蘿卜花青素的穩(wěn)定性及抗氧化性研究

＊廖凌姍 田圣 陳杰 熊竹 黃輝勝 袁斌芳

（長江師范學院化學化工學院 重慶 408100）

現(xiàn)代社會，隨著生活水平的大幅提升，人們比以往更加重視身體健康。大量研究表明，花青素具有抗氧化、延緩衰老、改善視力、防癌抗癌等功效，近年來備受關(guān)注[1]。然而，花青素價格普遍較高，受益人群小。胭脂蘿卜種植面積大，花青素含量高，提取工藝成熟，因此，胭脂蘿卜花青素成本低廉，售價相對較低，深受消費者青睞，市場潛力巨大。與其他來源的花青素一樣，胭脂蘿卜花青素也屬于類黃酮物質(zhì)，其基本結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃酮型陽離子，以C6-C3-C6為骨架，穩(wěn)定性不高，在各種物理、化學因素的影響下化學結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變而變質(zhì)[2]。本文以乙醇水溶液為提取液從胭脂蘿卜中分離出花青素，研究了自然光、溫度、pH、金屬離子等因素對其穩(wěn)定性的影響，同時考查了其抗氧化性能。

1.實驗材料與方法

(1)材料與試劑

胭脂蘿卜、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷標準品、ABTS、DPPH、過氧化氫、過硫酸鉀、抗壞血酸、硫酸亞鐵、溴甲酚紫、氟化鈉、磷酸氫二鈉、無水檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇。

(2)儀器與設(shè)備

PT3502C型酶標儀、U-3010型紫外-可見分光光度計、RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、LGJ-12型冷凍干燥機、PHS-3E型pH計、PTX-FA1205型全自動電子天平、Eurostar 20型機械攪拌器、HH-WO-5L型恒溫水浴鍋、BPG-9056A型鼓風干燥箱、DZF-6020型真空干燥箱、2XZ-2型旋片式真空泵。

(3)實驗方法

①胭脂蘿卜花青素的提取

將胭脂蘿卜切塊并打成漿狀，傾入層析柱中，加入體積比6:4的乙醇水溶液，靜置1h，打開活塞收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，-55℃冷凍干燥，得到胭脂蘿卜花青素粉末。

②胭脂蘿卜花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量的測定[3-4]

采用標準曲線法測定胭脂蘿卜花青素中的主要成分天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量。先將天竺葵素-3-O-葡萄糖苷標準品配制成不同質(zhì)量濃度的稀釋液，調(diào)節(jié)pH至3.0，測試吸光度；再配制不同質(zhì)量濃度的胭脂蘿卜花青素稀釋液，調(diào)節(jié)pH至3.0，測試吸光度；以系列質(zhì)量濃度梯度稀釋液最大吸收峰處（513nm）的吸光度為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制散點，并線性擬合成直線，得到標準直線；在標準直線上找出花青素稀釋液最大吸收峰處的吸光度所對應的標準品質(zhì)量濃度，并根據(jù)花青素稀釋液，按公式（1）計算花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的含量。

式中，Cs為標準品質(zhì)量濃度，mg/L；V為稀釋后花青素的體積，L；m為稱取的花青素質(zhì)量，g。

③胭脂蘿卜花青素的穩(wěn)定性研究[5]

A.自然光的影響。取10mL花青素樣液于比色管中，放于自然光照射處，每隔5～10天測定一次吸光度，連續(xù)測30天。B.溫度的影響。將10mL花青素樣液轉(zhuǎn)移至具塞試管中，分別于50℃、70℃、90℃下加熱1h、2h、3h、4h，測定吸光度。C.pH值的影響。利用檸檬酸、磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)花青素樣液pH為2.0、4.0、6.0、8.0，于50℃下水浴加熱1h、2h、3h、4h，測定吸光度。D.金屬離子的影響。量取10mL花青素樣液于4支具塞試管中，分別加入1mmol/L的Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+，調(diào)節(jié)pH至3.0，在50℃下加熱，加熱1h、2h、3h、4h，測定吸光度。

④胭脂蘿卜花青素的抗氧化活性研究[6]

A.ABTS?+清除能力的測定

將7mmol/L的ABTS水溶液和12.25mmol/L的K2S2O8水溶液按體積比5:1混合，避光放置12h得ABTS?+溶液。用無水乙醇稀釋ABTS?+溶液至吸光度為0.7左右，作為工作液。將50μL樣液1000μL工作液混合，在室溫下避光保存7min，轉(zhuǎn)移至ELISA板。對照組用抗壞血酸水溶液代替樣品。ABTS?+的特征吸收波長在734nm處，測定吸光度。ABTS?+清除率（SA）按公式（2）進行計算。

式中，Ac為50μL無水乙醇加入1000μL ABTS?+工作液的吸光度；As為50μL樣液加入1000μL ABTS?+工作液的吸光度。

B.DPPH?清除能力的測定

移取200μL樣液于一具塞試管中，加入現(xiàn)配等體積的0.6mmol/L DPPH?乙醇溶液，避光存放30min，引入ELISA板。對照組用抗壞血酸水溶液代替樣品。DPPH?的特征吸收波長在517nm處，測定吸光度。DPPH?清除率（SA）按照公式（3）進行計算。

式中，Ac為200μL無水乙醇與200μL DPPH?的吸光度；As為200μL樣液的吸光度。

C.OH?清除能力的測定

將0.4mL 0.5g/L溴甲酚紫乙醇溶液、將0.5mL 0.1mol/L鹽酸溶液、1.0mL 5mmol/L FeSO4溶液、0.5mL H2O2溶液依次傾入10mL具塞試管中，搖勻，稀釋至刻度，置于30℃水浴中反應8min，取出后立即加入0.2mL 0.1% NaF溶液終止反應。對照組用抗壞血酸水溶液代替樣品。OH?的特征吸收波長在420nm處，測定吸光度。OH?清除率（SA）按照公式（4）進行計算。

式中，As為反應液與待測樣品混合后的吸光度；A為反應液的吸光度；A0為溴甲酚紫、鹽酸混合液的吸光度。

2.結(jié)果與討論

(1)胭脂蘿卜花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量的測定

對pH3.0的樣液進行全波段掃描，得到可見光吸收光譜，如圖1所示。最大吸收峰出現(xiàn)在513nm處，峰值為0.909。花青素粉質(zhì)量為0.05g，稀釋后體積為100mL。根據(jù)標準直線（圖2）和公式（1）計算出花青素中天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量為26.8%。

圖1 pH3.0胭脂蘿卜花青素可見光吸收光譜

圖2 天竺葵素-3-O-葡萄糖苷標準直線

(2)胭脂蘿卜花青素穩(wěn)定性研究

①自然光的影響。室溫環(huán)境中，自然光照下暴露30天，樣液中的花青素不斷降解，吸光度隨之發(fā)生改變，變化趨勢如圖3所示。從圖3可以看出樣液的吸光度隨著時間的推移逐漸下降，30天后下降了69.7%。說明花青素對自然光非常敏感，長期儲存需要密封、避光。

圖3 自然光對胭脂蘿卜花青素的影響

②溫度的影響。花青素的穩(wěn)定性與溫度及加熱時間的關(guān)系如圖4所示。結(jié)果顯示，花青素受溫度影響較大，相同的加熱時間，加熱溫度為90℃時，花青素的降解率最高，加熱溫度為50℃時，花青素的降解率最低；加熱溫度為70℃時，花青素降解速率最小；相同加熱溫度下，加熱時間越長，花青素降解率越高。在90℃下加熱4h，降解率達47.3%；在70℃下加熱4h，降解率為39.9%，在50℃下加熱4h，降解率為38.6%。

圖4 溫度對胭脂蘿卜花青素的影響

③pH值的影響。將花青素樣液的pH值分別調(diào)至2.0、4.0、6.0和8.0，測試其吸光度，發(fā)現(xiàn)pH值為6.0和8.0時，最大吸收峰的位置移動到了532nm和580nm處，說明花青素的化學結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。圖5為花青素在50℃下pH值為2.0和4.0的酸性環(huán)境中加熱，吸光度隨時間的變化曲線。加熱4h后，pH值為2.0和4.0的樣液的吸光度分別下降了4.7%和27.2%。結(jié)果顯示，花青素在堿性環(huán)境中極不穩(wěn)定，在酸性較強的環(huán)境下穩(wěn)定性較高，應存放在酸性環(huán)境中。

圖5 pH值對胭脂蘿卜花青素的影響

④金屬離子的影響。在pH3.0的樣液中加入1mmol/L的金屬離子，50℃下加熱4h，間隔1h測試一次吸光度。金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響趨勢如圖6所示。顯然，不同的金屬離子對花青素穩(wěn)定性的影響有一定的差異，Zn2+和Mg2+能提高花青素的穩(wěn)定性；含Ca2+的樣液的吸光度變化曲線與花青素樣液的吸光度變化曲線重合，表明Ca2+的存在對花青素的穩(wěn)定性幾乎沒有影響；而Fe2+則會促進花青素的降解，導致其降解速度加快。

圖6 金屬離子對胭脂蘿卜花青素的影響

(3)胭脂蘿卜花青素抗氧化活性研究

①ABTS?+清除能力的測定。利用ABTS與K2S2O8反應生成藍綠色的ABTS?+，加入具有抗氧化活性的樣品，ABTS?+質(zhì)量濃度降低，溶液顏色變淺，吸光度發(fā)生改變。圖7是不同質(zhì)量濃度的花青素和抗壞血酸清除ABTS?+曲線。花青素清除ABTS?+的IC50為25mg/L，抗壞血酸為21mg/L，且在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，花青素清除ABTS?+的能力高于抗壞血酸，說明兩者清除ABTS?+的能力差異不大。

圖7 不同濃度的胭脂蘿卜花青素和抗壞血酸清除ABTS?+曲線

②DPPH?清除能力的測定。DPPH?在有機溶劑中能穩(wěn)定存在，其乙醇溶液為深紫色，將抗氧化活性物質(zhì)顏色變淺，吸光度產(chǎn)生變化。圖8為不同質(zhì)量濃度的花青素和抗壞血酸清除DPPH?曲線。花青素清除DPPH?的IC50為9mg/L，抗壞血酸為9.5mg/L；在低質(zhì)量濃度區(qū)間，花青素清除DPPH?的能力稍高于抗壞血酸，在高質(zhì)量濃度區(qū)間，抗壞血酸清除DPPH?的能力高于花青素；花青素對DPPH?有較強的清除能力，質(zhì)量濃度為25mg/L時，DPPH?清除率達86.0%。

圖8 不同濃度的胭脂蘿卜花青素和抗壞血酸清除DPPH?曲線

③OH?清除能力的測定。雙氧水與硫酸亞鐵反應生成OH?，遇溴甲酚紫顯黃色，添加抗氧化活性物質(zhì)，顏色變淡，吸光度發(fā)生變化。圖9為不同質(zhì)量濃度的花青素和抗壞血酸清除OH?曲線。花青素清除OH?的IC50為12mg/L，抗壞血酸為17mg/L；在整個質(zhì)量濃度區(qū)間，花青素清除OH?的能力均高于抗壞血酸；花青素對OH?有較強的清除能力，質(zhì)量濃度為25mg/L時，OH?清除率達81.3%。

圖9 不同質(zhì)量濃度的胭脂蘿卜花青素和抗壞血酸清除OH?曲線

3.結(jié)論

胭脂蘿卜花青素的穩(wěn)定性受自然光影響較大，在自然光照下室溫存放30天后吸光度下降了69.7%。花青素的穩(wěn)定性受溫度影響較大，熱穩(wěn)定性不夠高，在90℃下加熱4h，降解率達47.3%。花青素在堿性環(huán)境中化學結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變，在酸性較強的環(huán)境下穩(wěn)定性較高，應存放在酸性環(huán)境中。Zn2+和Mg2+能提高花青素的穩(wěn)定性，Ca2+對花青素的穩(wěn)定性幾乎沒有影響，F(xiàn)e2+會引起花青素加速降解。花青素的體外抗氧化活性較高，表現(xiàn)出較強的自由基清除能力，對于ABTS?+、DPPH?、OH?的IC50分別為25mg/L、9mg/L、12mg/L，與抗壞血酸相當。