響應面法優化姜根多酚類成分提取及純化工藝

＊肖湲 胡露 陳杰 聶艷峰 郭朝萬

（廣東丸美生物技術股份有限公司 廣東 510530）

引言

姜為多年生草本植物姜（Zingiberoffi cnale Rosc.），其根莖是一種重要的調味品，也是我國傳統的藥食同源植物[1]。姜酚是姜中一類具有生物活性的酚類化合成分，由于苯環的取代基不同、位置不同及側鏈長短、環化與否等差異，組成了許多分子質量不同、分子結構僅略有差異的不同姜酚類物質，包括6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等，其中6-姜酚含量最高[2]。姜酚中苯環和長鏈烴的結構決定其易溶于有機溶劑體系，難溶于水[3]。在提取過程中姜酚成分在加熱、酸、堿及其他氧化劑存在的環境下極易發生降解反應、脫水反應和氧化反應，這些均給其分離、提純工作帶來了很大的難度[4]。此外，姜酚中苯環上含有的甲氧基、酚羥基等結構的破化也會影響到姜酚的原本的生物活性[5]。

目前姜酚提取的方法主要有溶劑浸提法[6]、壓榨法[7]、超聲波輔助提取法[8]、微波輔助提取法[9]、超臨界CO2萃取法和滲漉提取法[10]。其中，超聲波提取技術具有提取速度快、選擇性好、操作方便及有利于活性成分的保留等特點。經過溶劑提取的姜酚成分往往還存在較多的雜質，因此還需要合適的分離方式純化姜酚。在姜酚的分離純化研究中最常見的就是大孔樹脂吸附法[11]、硅膠柱層析法[12]、高速逆流色譜法[7]等，本文采用單因素和響應面實驗方法優化生姜中多酚成分的提取工藝，為姜酚的工藝生產提供理論指導。

1.材料和儀器

（1）材料：姜根，購于市售新鮮樣品，于冷凍干燥離心機凍干后再進行提取；試劑：沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、蒸餾水、乙醇。

（2）儀器：紫外分光光度計UV-2600（日本，島津）、萬分之一天平（德國，賽多利斯）、中藥粉碎機（淄博粉體設備有限公司）、數顯恒溫水浴鍋HH系列-1型、電熱恒溫鼓風干燥箱（DGG-9023A）、冷凍干燥離心機（FD-2A-80）、超聲儀380W。

2.實驗方法

(1)多酚標準曲線的繪制

以沒食子酸作為標準對照。分別配制質量濃度為0.05 mg/mL、0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL的沒食子酸乙醇溶液，分別取2mL加入1mL福林酚試劑，搖勻后靜置30s，加入2mL 12% Na2CO3，用蒸餾水定容至20mL，搖勻，在765nm處測定吸光度值，以質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，制定標曲。本實驗得到的標準曲線方程為：A=0.0089c+0.0858，R2=0.997，沒食子酸質量濃度在0.05～0.3mg/ml范圍內呈現良好的線性范圍。

(2)多酚成分提取單因素實驗

根據預實驗結果，實驗基本設定為取生姜粉末1g，加入75%乙醇20mL，功率100%，在50℃下，超聲提取20min，4500r離心4min，得到濾液，按以上方法測定姜酚含量。實驗因素條件為：料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25）、提取時間（10min、15min、20min、25min、30min）、提取溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、乙醇體積分數（55%、60%、75%、80%、95%）。

(3)多酚成分提取響應面實驗

基于上述單因素實驗結果，進一步采用Design-Expert 8.0.6軟件設計Box-Behnken中心組合實驗設計，主要分析了料液比（A）、乙醇體積分數（B）、提取時間（C）3個因素之間的相互作用對姜酚得率（Y）所產生的影響。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析實驗因素及水平表

3.結果與分析

(1)單因素實驗優化

①研究提取料液比對姜酚提取得率的影響

由圖1A可知，在一定的料液比范圍內，隨著料液比的增加，姜酚的溶解度也隨之增大，從而使得總多酚含量也隨之增加，在料液比1:25的條件下，總多酚得率達到最高，再隨著料液比的增加，多酚可能由于雜質的析出而溶解度下降，從而使得得率也相應下降，因此在料液比1:25的條件下，提取率相對最高。

圖1 提取條件單因素試驗結果

②研究提取時間對姜酚提取得率的影響

由圖1B可知，隨著提取時間的增加，總多酚含量呈現先增加后下降的趨勢，在時間20min達到最高點，而時間超過20min之后，超聲波的作用也會破壞姜酚中的一些不穩定成分，從而降低總多酚的含量。

③研究提取溫度對姜酚提取得率的影響

如圖1C所示，為了避免多酚成分在高溫作用下氧化破化，選擇溫度在30～70℃下提取，通過溫度變化可以發現，溫度在50℃提取條件下，更加有利于多酚成分的釋放，同時也避免了多酚成分的破化，從而在50℃下，提取率達到最高。

④研究乙醇體積分數對姜酚提取得率的影響

如圖1D所示，隨著乙醇體積分數的變化，姜酚提取得率隨著乙醇體積分數的增加先增加后下降，當乙醇體積濃度為75%時，姜酚提取得率相對最高。而當乙醇體積濃度超過75%后，可能由于生姜細胞中的色素、雜質等脂溶性成分的溶出量增加，導致多酚的溶解度下降。因此選擇乙醇體積濃度75%較為合適。

(2)響應面結果與分析

①響應面數據處理

響應面數據結果如表2所示，以料液比A，時間B，乙醇體積分數C為自變量，以姜酚得率Y為響應值，通過軟件進行多元回歸方程擬合發現：得到自變量與因變量的回歸方程：Y=0.53-0.084×A-0.059×B-0.041×C-0.041×A×B-0.059×A×C-0.012×B×C-0.18×A2-0.19×B2-0.19×C2，同時由表3所知，回歸模型的P值小于0.01，說明該模型具有顯著性，一次項中的A料液比總多酚得率有顯著影響；二次項A^2、B^2、C^2影響極顯著；各因素對得率的影響大小為料液比＞提取時間＞乙醇體積分數。

表2 響應面實驗設計結果

表3 響應面回歸模型方差分析

續表

②各因素交互作用分析及驗證

由圖2～圖4可知，沿著曲線上各因素的坡度的變化和等高線密度變疏，等高線呈圓型，因此各因素交互關系不顯著。同時預測最佳參數：料液比1:30，提取時間20min，乙醇體積分數65%，提取率為1.0%；為考察結果的準確性進行驗證實驗，選擇料液比:1:30，提取時間20min，乙醇體積分數65%，多酚成分實際提取率為（0.98±0.02%），與預測值接近，在該試驗模型下得到的最佳工藝條件具有一定的參考價值，有待于進一步工藝生產放大驗證。

圖2 料液比與時間的交互作用

圖3 料液比與乙醇體積分數的交互作用

圖4 乙醇體積分數與時間的交互作用

3.結論

本實驗以姜酚得率為評價指標，通過單因素實驗得到，當料液比為1:25，提取時間為20min，提取溫度為50℃，乙醇體積分數為75%，超聲提取功率為90%（342W）的條件下，總多酚的提取得率達到最高1.52±0.05%，同時運用響應面優化三因素（料液比，乙醇體積分數，提取時間）對姜根多酚提取率的影響力依次為料液比＞乙醇體積分數＞提取時間，結合軟件分析，并對二次多項回歸方程模型的最佳條件進行驗證，在實際操作時，將各工藝參數修正為：乙醇體積分數65%，料液比1:3，提取時間為20min。通過試驗驗證得到總多酚提取率為（0.98±0.02%），實際值與預測值十分接近，模型建立基本成功。