液體有機酸協同牛至香酚對畜禽有益菌和有害菌抑菌性能的研究

◆作者：程皇座 胡友軍,2* 陸信芳 趙曉南 劉堅

◆單位：1.廣東酸動力生物科技有限公司創新中心；2.廣東酸能生物科技有限公司創新中心

酸制劑具有無毒、無污染、無殘留的特性，最初是作為一種風味添加劑使用，用于改善動物飼料的適口性。隨著研究的深入，發現酸制劑還具有降低飲水和飼料中的pH 值、降低飼料系酸力、提高消化酶活性、促進營養物質消化、防霉保鮮和抑菌抗病毒作用。特別是在飼料禁抗后，酸制劑良好的抑菌性能受到大家關注。大量研究表明，在畜禽養殖過程中，酸制劑能夠抑制多種病原，起到顯著抗菌作用，例如甲酸對沙門氏菌、致病弧菌，苯甲酸對大腸桿菌、沙門氏菌，丙酸對真菌、霉菌等均有良好的抑制作用（李成良，2006）。而在動物養殖上應用，Lan 等（2018）在給母豬飼喂0.2%的富馬酸、檸檬酸、癸酸組成的酸制劑，發現分娩期腸道乳酸桿菌提高1.2%，哺乳期乳酸桿菌提高2.2%，大腸桿菌降低2.0%。但也有研究表明，有機酸對腸道微生物沒有影響，Risley 等（1992）研究表明，有機酸對仔豬胃、空腸、盲腸和結腸中乳酸菌、梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌數量沒有顯著影響。可見有機酸抑菌效果并不統一，這可能與有機酸種類、用量、動物健康狀態等因素有關。本試驗篩選2 種有害菌（大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌）和3種有益菌（凝結芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌），研究有機酸單獨和協同牛至香酚對其抑制作用，為商品化有機酸在動物生產上的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

液體有機酸：商品名為富酸寶，主要成分為甲酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、丙酸等，由廣東酸動力生物科技有限公司提供。

微生物菌：凝結芽孢桿菌粉、嗜酸乳桿菌粉、丁酸梭菌粉，由江西水微新飼料有限公司提供。大腸埃希氏菌液、金黃色葡萄球菌液，購自清遠景駿化工貿易有限公司。

牛至香酚：由江西水微新飼料有限公司提供。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗處理分組

試驗分為2 大組，每個大組又分為5 個小組，第1 大組為液體有機酸單獨添加，其中分為不同稀釋度液體有機酸，分別為0倍、750 倍、1500 倍、2250 倍、3000 倍稀釋添加；第2 大組為液體有機酸協同牛至香酚添加，分別為0 倍、750 倍、1500 倍、2250倍、3000 倍稀釋添加。

1.2.2 有機酸單獨作用菌液制備

先將液體有機酸稀釋成0倍（無菌水代替）、750 倍、1500倍、2250 倍、3000 倍。分別吸取20mL 不同稀釋度液體有機酸于錐形瓶中，并在裝有不同稀釋度液體有機酸中添加0.1g 凝結芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌和0.2mL 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌，制成一定含菌濃度（凝結芽孢桿菌含量為5×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌含量為5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量為5×106CFU/mL，大腸埃希氏菌含量為5×107CFU/mL，金黃色葡萄球菌含量為 5 ×107CFU/mL）樣品，用恒溫振蕩器200 rpm/min，振蕩3min，置室溫1h。每個稀釋度做3 個重復。

1.2.3 有機酸協同牛至香酚作用菌液制備

先將液體有機酸稀釋成0倍（無菌水代替）、750 倍、1500倍、2250 倍、3000 倍。量取10mL不同稀釋度液體有機酸于錐形瓶中，再分別加入10mL 牛至香酚，混勻后，再在裝有不同稀釋度液體有機酸中添加0.1g 凝結芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、丁酸梭菌菌粉和0.2mL 大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌，制成一定含菌濃度（凝結芽孢桿菌含量為5×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌含量為5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量為5×106CFU/mL，大腸埃希氏菌含量為5×107CFU/mL，金黃色葡萄球菌含量為 5 ×107CFU/mL）樣品，用恒溫振蕩器200 rpm/min，振蕩3min，置室溫1h。每個稀釋度做3 個重復。

1.2.4 微生物接種培養

將1.2.3 中各稀釋度樣品在室溫存放作用1h 后，以無菌操作方法吸取1mL 充分混勻的樣品，注入盛有9mL 滅菌生理鹽水試管中，混勻成10-1稀釋液。吸取10-1的稀釋液1mL 注入盛有9mL 滅菌生理鹽水的試管中，混勻成10-2稀釋液，按同法依次稀釋至10-8稀釋液備用，然后將稀釋液以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL 充分混勻的樣品，注入滅菌平皿中，傾注約15mL 已融化并冷卻到45℃左右的瓊脂固體培養基，并立即旋搖平皿，使樣品與培養基充分混勻。待冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，凝結芽孢桿菌于48℃培養箱內培養48h，嗜酸乳桿菌于37℃培養箱內厭氧培養72h，丁酸梭菌于37℃培養箱內厭氧培養48h，大腸埃希氏菌于37℃培養箱內培養24h，金黃色葡萄球菌于37℃培養箱內培養48h，培養結束后進行菌落計數，菌落個數乘以稀釋倍數即為1mL 樣品中的活菌菌落總數。

1.2.5 菌落計算

菌種存活率為各處理樣品中活菌數占無菌水樣品中活菌數（凝結芽孢桿菌含量為5×108CFU/mL，嗜酸乳桿菌含量為5×108CFU/mL，丁酸梭菌含量為50×106CFU/mL，大腸埃希氏菌含量為5×107CFU/mL，金黃色葡萄球菌含量為 5 ×107CFU/mL）的百分比。

2 結果與分析

由表1 可知，液體有機酸作用1h 對嗜酸乳桿菌活菌率具有中等程度抑制作用，活菌率與對照相比均在30%～49%之間，稀釋倍數越高活菌率越高；聯合添加牛至香酚將極大程度抑制活菌率低至10%。

表1 不同濃度液體有機酸協同牛至香酚對嗜酸乳桿菌抑活作用

由表2 可知，液體有機酸作用1h 對大腸埃希氏菌活菌率具有很強抑制作用，稀釋至750 倍未檢出大腸埃希氏菌，稀釋至1500 倍時，活菌率低至6.47%。即聯合添加牛至香酚將極大抑制大腸埃希氏菌生長。

表2 不同濃度液體有機酸協同牛至香酚對大腸埃希氏菌抑活作用

由表3 可知，液體有機酸作用1h 對丁酸梭菌活菌率具有輕微抑制作用，活菌率與對照相比均在75%～86%，稀釋至3000 倍活菌率與750 倍活菌率接近。液體有機酸作用1h 對金黃色葡萄球菌活菌率具有極強抑制作用，稀釋至2250 倍均未有檢出活菌；稀釋至3000 倍活菌率也僅為1.57%；

表3 不同濃度液體有機酸對丁酸梭菌和金黃色葡萄球菌抑活作用

由表4 可知，與對照組相比，液體有機酸作用1h 凝結芽孢桿菌活菌率均高于對照組，具有一定促進凝結芽孢桿菌增殖效果，活菌率與對照相比均在1.57～1.85 倍，稀釋至3000 倍活菌率與750 倍活菌率接近。液體有機酸對凝結芽孢桿菌作用2h，所有加酸組凝結芽孢桿菌活菌率均高于對照組，活菌率與對照相比均在1.37～2.06 倍。

表4 不同濃度液體有機酸對凝結芽孢桿菌抑活作用

3 討論

本試驗中，在水中添加液體有機酸作用1～2h 時，能促進凝結芽孢桿菌增殖，這是因為凝結芽孢桿菌具有顯著的抗逆性，具有耐胃酸、耐膽鹽、耐高溫高壓、復活率高等特性，研究表明，凝結芽孢桿菌經口服進入胃后，在胃液酸性條件下會被活化，芽孢衣膨脹，水分增加，代謝加快（牛自康，2019；柯軻，2021），因此，一定的酸性環境能夠促進其生長增殖。而本試驗選擇的液體有機酸對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制作用很大，在不添加牛至香酚情況下液體有機酸稀釋750 倍時對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑制率達95%以上，說明這兩種畜禽常見病菌對酸的敏感性很高。

本試驗研究還發現，液體有機酸作用1h 對丁酸梭菌活菌率具有輕微抑制作用，對嗜酸乳桿菌活菌率具有中等程度抑制作用，而協同牛至香酚強烈抑制嗜酸乳桿菌和大腸埃希氏菌增殖，說明不同的微生物對酸具有不同的耐受作用，而協同牛至香酚具有更好的抑菌效果，這可能是因為牛至香酚能夠破壞細菌細胞膜的完整性，增加膜通透性，使細菌對酸性環境更為敏感（Basmacioglu-Malayoglu，2016）。

綜合看來，單獨添加液體有機酸（750 ～1500 倍稀釋）有利于凝結芽孢桿菌增殖，對丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌影響較小，可強烈抑制金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌，因而更有利于酸制劑維持體內有益菌和有害菌之間的微生態平衡；聯合添加牛至香酚，盡管進一步抑制了濃度本就極低的大腸埃希氏菌數，但嚴重抑制了嗜酸乳桿菌活菌數，因此可根據實際情況謹慎使用，其作用機理和對其他微生物的聯合添加效應的影響關系還應進一步研究。

4 結論

液體有機酸對畜禽常見病原菌具有抑制作用，對常見有益菌生長繁殖具有促進作用，并且在協同牛至香酚作用下更明顯，但其抑菌效果跟多種因素有關，在實際畜禽生產中應用需結合實際情況進行選擇和考慮。

參考文獻：（略）