花旗松素通過PI3K/AKT/mTOR通路對宮頸癌SiHa細胞自噬、凋亡和衰老的影響*

陳海燕，曾雪莉

（湖北省隨州市曾都醫院婦產科，隨州 441300）

宮頸癌（cervical cancer）在子宮頸表面的組織中發展，是影響全世界女性的最常見的癌癥之一，每年有大量的的女性因此而死亡[1]。發生子宮頸癌的主要危險因素是人乳頭瘤病毒（HPV）的持續感染，且其感染通常是無癥狀和短暫的[2]。篩選和治療方法的進步顯著改善了臨床結局，然而由于對標準療法化療的耐藥性發展，晚期宮頸癌的治療仍然是一個挑戰[3]。因此探尋治療宮頸癌的有效方式是迫切的。抗腫瘤中藥由于高抗癌效力和低毒性，已在臨床上得到廣泛應用，傳統中藥與健康生活方式的結合通常可以完全緩解輕度和中度疾病。花旗松素（Taxifolin）又名二氫槲皮素、紫葉杉素，是提取自水紅花子、土茯苓等植物中的一種生物類黃酮準維生素P，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、消炎等多種藥理活性[4]。已有研究表明花旗松素具有良好的體外抑制人宮頸癌Hela細胞增殖作用[5]。目前還沒有關于花旗松素對宮頸癌SiHa細胞影響的研究，本文旨在研究花旗松素對宮頸癌SiHa細胞自噬，凋亡和衰老的影響，以期為宮頸癌的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑 花旗松素（批號：111816-201102，純度≥98.9%，中國食品藥品檢定研究院）；達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）培養基、胎牛血清、胰蛋白酶和青-鏈霉素（貨號分別為：12100-046、10082-147、10082-147、15140-122，均購于美國 Gibco公司）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（批號：G020-1-1，南京建成生物工程研究所）；CCK-8試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號分別為：C0037、P0012S、C1062S，上海碧云天生物技術研究所）；兔抗單克隆抗體Beclin1、p62、LC3II/LC3I、Bcl-2、Bax、Caspase-3、cleaved caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶 B（AKT）、p-AKT、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR（貨號分別為：ab62557、ab56416、ab128025、ab196495、ab53154、ab13847、ab2302、ab52298、ab2324、ab191606、ab182651、ab106693、ab192623、ab2732、ab84400，英國Abcam公司）。

1.2 細胞及細胞培養 人子宮頸鱗狀癌SiHa細胞株（購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫），細胞培養于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養基中，并放置在37℃，5% CO2恒溫培養箱中。培養基每2～3 d更換1次，當需要收集細胞時，用0.25%胰蛋白酶消化。實驗用細胞為對數生長期細胞。

1.3 MTT檢測細胞增殖 將宮頸癌SiHa細胞接種于96孔板（100 μL/孔）孵育24h后，用不同濃度（0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20、40、80、120、150、200 μmol/L）花旗松素處理細胞，置于37℃，含5% CO2細胞培養箱中培養24 h，每孔加入MTT溶液50 μL，孵育4 h，吸出上清液，每孔加 150 μL DMSO，用平板搖床搖勻，用酶標儀在570 nm處檢測各濃度OD值。實驗重復3次，取平均值并計算藥物半數抑制濃度IC50值，選擇 20 μmol/L Taxifolin 為最高濃度，倍數遞減確定給藥濃度梯度為：20、10、5 μmol/L 進行后續實驗。

1.4 CCK-8法檢測細胞細胞增殖倍數 取對數生長期宮頸癌SiHa細胞，胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以每孔4×103個細胞接種于96孔板，每孔100 μL，培養 24 h，加入 Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）處理24、48、72 h，于每個檢測時間點（0、24、48、72 h）分別加入稀釋到10%的CCK-8溶液10 μL，置于37℃，含5% CO2細胞培養箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm處檢測吸光值，計算細胞增殖倍數。

1.5 Western blot 檢 測 Beclin1、p62、LC3II/LC3I、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 及凋亡相關蛋白表達水平 取對數生長期宮頸癌SiHa細胞接種至6孔板，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中，加入 Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）處理 24 h，處理后將細胞用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）將清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質含量；提取等量蛋白質樣品，100℃變性5 min。然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%的牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉2 h后加入相應的一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用ImageJ軟件統計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復3個獨立的實驗。

1.6 免疫熒光檢測LC3+含量 將經Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）處理 24 h 后的宮頸癌 SiHa 細胞接種于細胞爬片上，用PBS浸洗3次，每次3 min；用多聚甲醛固定15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。0.5% Triton X-100室溫通透20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，吸掉封閉液，加入一抗，孵育過夜，PBS浸洗，避光加入熒光二抗，孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 流式檢測細胞凋亡 宮頸癌SiHa細胞經Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）處理 24 h，胰酶消化收集各組懸浮細胞到10 mL的離心管中，每樣本細胞數為 3×106/mL，1 000 r/min 離心 5 min，棄去培養液，用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，用100 μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時振動，流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.8 JC-1法檢測線粒體膜電位 將宮頸癌SiHa細胞接種于 6 孔板中，加入 Taxifolin（0、5、10、20μmol/L）處理24 h后用PBS清洗3次，孵育24 h，加入JC-1（5 μg/mL）室溫避光反應30 min。用流式分選儀檢測，記錄紅色和綠色熒光強度。

1.9 加入AKT激活劑SC79對SiHa細胞的影響 選擇20 μmol/L劑量花旗松素處理細胞，將細胞隨機分為 4 組：Control組、Taxifolin 20 μmol/L 組、SC79組和Taxifolin 20 μmol/L+SC79組。Control組不做處理，Taxifolin 20 μmol/L 組用 20 μmol/L 花旗松素處理 24 h，SC79組用 AKT激活劑 SC79處理 24 h，Taxifolin 20 μmol/L+SC79 組用 20 μmol/L 花旗松素和AKT激活劑SC79聯合處理24 h。檢測各組細胞凋亡、自噬及相關蛋白表達。

1.10 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 降低宮頸癌SiHa細胞活力 與Taxifolin 0 μmol/L濃度時相比較，Taxifolin 40、80、120、150、200 μmol/L 濃度細胞活力顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 Taxifolin不同濃度處理宮頸癌SiHa細胞24 h細胞活力的變化

2.2 抑制宮頸癌SiHa細胞增殖 與Taxifolin 0 μmol/L 組相比較，Taxifolin 10、20 μmol/L 組細胞增殖倍數顯著降低（P＜0.05）。結果見圖2。

圖2 各組宮頸癌SiHa細胞增殖倍數的比較

2.3 誘導宮頸癌SiHa細胞自噬 與Taxifolin 0 μmol/L 組相比較，Taxifolin 10、20 μmol/L 組 p62蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3。

圖3 各組宮頸癌SiHa細胞自噬蛋白Beclin1、p62、LC3II、LC3I的比較

2.4 升高宮頸癌SiHa細胞LC3+含量 與Taxifolin 0 μmol/L 組相比較，Taxifolin 10、20 μmol/L 組 LC3+含量顯著升高（P＜0.05）。結果見圖4。

圖4 各組宮頸癌SiHa細胞LC3+含量的比較

2.5 促進宮頸癌SiHa細胞凋亡 與Taxifolin 0 μmol/L 組相比較，Taxifolin 5、10、20 μmol/L 組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。結果見圖5。

圖5 各組宮頸癌SiHa細胞細胞凋亡率的比較

2.6 升高宮頸癌SiHa細胞線粒體膜電位 與Taxifolin 0 μmol/L 組相比較，Taxifolin 5、10、20 μmol/L 組線粒體膜電位顯著升高（P＜0.05）。結果見圖6。

圖6 各組宮頸癌SiHa細胞線粒體膜電位的比較

2.7 降低宮頸癌SiHa細胞Bcl-2/Bax比值，升高cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值 與Taxifolin 0 μmol/L組相比較，Taxifolin 10、20 μmol/L 組 Bcl-2/Bax 比值顯著降低（P＜0.05），cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值升高（P＜0.05）。結果見圖7。

圖7 各組宮頸癌SiHa細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表達水平的比較

2.8 降低宮頸癌SiHa細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 比值 與 Taxifolin 0 μmol/L組相比較，Taxifolin 10、20 μmol/L 組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 比值顯著降低（P＜0.05）。結果見圖8。

圖8 各組宮頸癌SiHa細胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平的比較

2.9 加入AKT激活劑后花旗松素對SiHa細胞的影響 與Control組相比較，Taxifolin 20 μmol/L組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 比值和P62蛋白水平顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率和Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。SC79 組 Taxifolin 20 μmol/L 組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值和P62蛋白水平顯著升高（P＜0.05），細胞凋亡率和 Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與SC79組相比較，Taxifolin 20 μM+SC79 組 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值和P62蛋白水平顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率和 Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。結果見圖9。

圖9 加入AKT激活劑后花旗松素對SiHa細胞的影響

3 討論

宮頸癌是全世界女性中最常被診斷出的癌癥，僅次于乳腺癌，結腸直腸癌和肺癌[6]。在許多不發達國家，宮頸癌患者的5年生存率不到40%[7]。由于宮頸癌的強大增殖，侵襲和轉移能力，晚期宮頸癌患者的預后仍然很差。由于化學療法的治療是有限且昂貴的，因此探尋治療宮頸癌的藥物是迫切的。花旗松素是維生素P族中的一種有機化合物，是一種植物黃酮類化合物，大量研究表明花旗松素對多種腫瘤具有抑制作用。本研究發現，花旗松素具有抑制宮頸癌SiHa細胞活力的作用。

抗癌藥活性的主要機制之一是抑制癌細胞的生長。Li等[8]研究發現花旗松素通過抑制乳房癌細胞增殖對乳房癌具有治療作用。Manigandan等[9]研究發現通過干預腫瘤細胞增殖和分化過程中的中的Wnt/β-catenin通路，發現花旗松素可以對結腸癌起到抑癌的作用。本文與上述結果研究一致，結果表明花旗紅素具有抑制宮頸癌SiHa增殖作用。

自噬抑制某些癌細胞的生長[10]。自噬是一種主要的細胞內降解過程，參與維持機體的內環境穩態，近年來研究發現自噬功能異常與宮頸癌的發生發展以及治療耐受等密切相關[11]。Beclin1是酵母Atg6基因在人類基因中的同源體，上調Beclin1的表達可誘導自噬的形成[12]。自噬標記蛋白p62是多泛素化結合蛋白，自噬發生缺陷可以上調p62的表達。LC3由可溶形式LC3I和脂化形式（稱為LC3Ⅱ）組成。LC3Ⅱ的存在與自噬直接相關，因為LCⅡ是在自噬小體形成中募集的，細胞應激觸發LC3Ⅰ綴合到磷脂酰乙醇胺以構成lapidated LC3Ⅱ，這是自噬體的一個組件，是自噬的標記物[13]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例反應了自噬水平情況。本研究發現，花旗紅素具有下調宮頸癌SiHa細胞Beclin1蛋白表達水平，上調p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平的作用。提示花旗紅素可誘導宮頸癌SiHa細胞自噬。

細胞凋亡是細胞的程序性死亡，凋亡維持細胞的存活及死亡平衡，細胞凋亡缺陷可引起癌癥自身免疫，而細胞凋亡增強則可引起退行性疾病[14]。線粒體在哺乳動物細胞凋亡的內在途徑中具有重要作用。在各種類型的癌癥中，凋亡抑制劑被高度表達，而凋亡啟動子大多被滅活，導致一定程度的耐藥性。因此，通過調調控在癌細胞中的細胞凋亡的正常響應的再活化是希望的治療方法[15]。Zhou等[16]研究發現花旗紅素通過誘導凋亡，細胞周期停滯和抑制PI3K/AKT/mTOR途徑來抑制瘢痕細胞癌的生長。符小玲等[17]研究發現花旗松素可以時間和濃度依賴性的方式抑制體外培養的人非小細胞肺癌細胞增殖并促進其凋亡。本文與上述結果研究一致，結果表明花旗紅素具有促進宮頸癌SiHa細胞凋亡的作用。

線粒體膜電位是由存在于線粒體內膜的質子泵將基質內的質子泵入外室所形成的橫跨線粒體內膜的線粒體膜電位，其為維持線粒體進行氧化磷酸化、產生三磷酸腺苷、保持線粒體功能的基礎[18]。Xiao等[19]研究發現花旗松素通過抑制線粒體膜電位下降，減輕ROS從而保護H9C2細胞的氧化應激損傷。本研究發現，花旗紅素具有升高宮頸癌SiHa細胞線粒體膜電位的作用。

細胞衰老是指細胞脫離細胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進入的一種相對穩定的狀態，是正常細胞的必然歸宿。而越來越多的研究發現，腫瘤細胞往往具有衰老障礙而表現出無限增殖的能力。在多種衰老細胞中，某些抑癌基因的過表達會引起細胞進入衰老程序，細胞繞過衰老途徑是其永生化及癌變進展的必要條件。本研究發現，花旗紅素具有降低宮頸癌SiHa細胞Bcl-2/Bax mRNA水平，升高Caspase-3、Caspase-9水平的作用。提示花旗紅素可抑制宮頸癌SiHa細胞衰老。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號傳導通路是哺乳動物細胞內重要的信號傳導通路之一，它通過影響其下游多種效應分子的活化狀態，發揮抑制細胞凋亡、促進增殖的作用。Zhou等[16]研究發現花旗松素通過誘導凋亡，細胞周期停滯和抑制PI3K/AKT/mTOR途徑來抑制瘢痕細胞癌的生長。本研究發現，花旗松素具有降低宮頸癌SiHa細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值的作用，且加入PI3K/AKT信號通路激活劑SC79可逆轉花旗松素對SiHa細胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響。提示花旗松素通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化調控宮頸癌SiHa細胞的生物學行為。

綜上所述，花旗松素對宮頸癌SiHa細胞具有抑制增殖、衰老，促進凋亡、自噬，升高線粒體膜電位的作用，這可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化實現的，提示花旗松素可用于臨床治療宮頸癌的潛力，為臨床治療提供實驗依據。但花旗松素難溶于水，導致生物利用率低，限制了其在醫藥和臨床上的使用，下一步計劃研究提高花旗松素的生物利用率。