布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白生物信息預測

薄雅寧，莊添瑞，高 玥，孫靖楠，胡 海，王 銳，高志祥，于 慧*

（1.包頭醫學院烏蘭察布臨床醫學院；2.包頭醫學院公共衛生學院；3.包頭醫學院中醫學院；4.包頭醫學院口腔醫學院；5.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院，內蒙古 包頭 014040；6.內蒙古自治區人民醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特 010010）

布魯氏菌（Brucella）是一種胞內寄生革蘭氏陰性菌，布魯氏菌所致的布魯氏菌病為一種人畜共患病。布魯氏菌的自然宿主以牛、羊等家畜以及人類為主。感染會導致家畜的睪丸炎、流產或不孕不育；人感染后引發波狀熱，臨床并發心內膜炎、肝脾腫大、關節病變或骨髓增生等，以生殖系統疾病為多[1]。隨著研究不斷進展，根據宿主偏好性和生化表型對布魯氏菌的分類也越來越多，但是人類對于防治布魯氏菌依然沒有效果較為理想的疫苗。

外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMP）是一種僅存在于革蘭氏陰性菌中的特殊蛋白質，通常具有一個跨膜結構域，位于細菌外膜，該跨膜結構域是細菌存活和毒力發揮的關鍵因素，主要包括OmpA、OmpW等[2]。由于布魯氏菌的外膜蛋白具有較強的免疫原性，所以布魯氏菌可以逃避巨噬細胞的免疫監控與反應。細胞死亡分析顯示，T4SS效應VceC和兩個不同的分泌蛋白OmpW家族蛋白（BAB1_1579和蛋白BAB1_1185）與布魯氏菌細胞毒性有關。這項研究提出對于布魯氏菌細胞毒性相關的分子機制新的見解和為布魯氏菌篩選候選疫苗的篩選提供有價值的信息[3]。

對布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白進行生物信息學分析，可以進一步了解OmpW家族蛋白基因表達、蛋白質特性、蛋白質結構功能、免疫學特性等相關信息，為日后深入研究其作用提供更多理論依據，也為研發更加安全有效的布魯氏菌疫苗和臨床治療藥物提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

從NCBI-Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）基因數據庫找到不同種布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列和蛋白質氨基酸序列。

1.1 蛋白質理化性質分析運用在線分析工具ProtPararm （https://web.expasy.org/protparam/）分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的一些物理和化學參數，如氨基酸和原子組成、正負電荷殘基數、分子量、等電點、分子式、半衰期、不穩定系數、脂肪族指數、親水性系數等。

1.2 蛋白質跨膜結構域及信號肽預測運用TMHMM預測布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的跨膜結構域；使用novopro網站（https://novopro.cn/tools/signalp）預測布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的信號肽。

1.3 蛋白質的糖基化及磷酸化位點預測通過NetPhos3.1 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預測布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白磷酸化作用位點，采用NetNGlyc1.0在線分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白糖基化作用位點。

1.4 蛋白質二級結構預測通過UCL（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）在線分析工具預測布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的二級結構。

1.5 蛋白質的三級結構預測及建模利用在線軟件SWIWW-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/GBJVfy/models/）預測并建立布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的三級結構模型。

1.6 B、T細胞抗原表位預測通過ABCPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）預測布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的B細胞抗原表位；通過NetMHCcons-1.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCcons-1.1）預測該蛋白的T細胞抗原表位。

2 結果

2.1 不同種布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列從NCBI-Gene數據庫中獲得馬耳他氏布魯氏菌、豬布魯氏菌、犬布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌、流產布魯氏菌、中間型布魯氏菌中外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列，見表1。

表1 各類布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因ID

以上6種布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因一致，共有684個堿基，基因序列NCBI-Gene基因數據庫中可查詢。

2.2 OmpW家族蛋白的氨基酸序列OmpW家族蛋白基因編碼蛋白共含有227個氨基酸殘基，見表2。

表2 各氨基酸比例數目

2.3 OmpW家族蛋白的理化性質ProtPararm在線分析工具分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白理化性質。布魯氏菌外膜蛋白OmpW分子式為C1136H1717N281O321，脂肪族指數為91.63，理論pI值為5.67，原子總數為3 457，其氨基酸序列Ala（A）占12.3%、Gly（G）占10.6%。正電荷殘基（Arg+Lys）、負電荷殘基（Asp+Glu）總數分別為16和18，其不穩定系數為23.01。該蛋白為穩定蛋白，親水性系數為GRAVY為0.143。體外哺乳動物的網織紅細胞半衰期是30 h，酵母體內半衰期為＞20 h，大腸桿菌體內半衰期＞10 h。

2.4 OmpW家族蛋白的跨膜結構域及信號肽預測經過TMHMM Server v.2.0對于布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白進行跨膜結構域預測，結果顯示在其7～29位氨基酸處存在有一個跨膜結構域，見圖1。

圖1 跨膜結構域預測

經novopro網站進行OmpW蛋白信號肽預測，結果顯示有信號肽的概率為：96.481%，信號肽類型：SP（Sec/SPI）；切割位點：26～27，概率：97.400%。

2.5 OmpW家族蛋白的糖基化和磷酸化分析經過NetPhos3.1進行布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白磷酸化位點預測。發現存在17個磷酸化位點，分別位于第15、87、98、132、148、156、209、221、224位蘇氨酸（T）；位于第61、72、100位酪氨酸（Y）；位于第43、66、68、73、108位絲氨酸（S）等氨基酸處（見圖3）；并存在1個N-糖基化位點，位于第146位（0.6939）氨基酸處（見圖4）；沒有發現存在O-糖基化位點。

圖3 磷酸化位點

圖4 糖基化位點

2.6 OmpW家族蛋白的二級結構預測布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的二級結構中有鏈（Strand）13個，螺旋（Holix）2個，卷曲（Coil）16個，見圖5、圖6。

圖5 二級結構預測

圖6 二級結構預測

信號肽序列：MPWMNRFARGLLAATALTFAAPAAFA，見圖2。

圖2 信號肽預測

2.7 OmpW家族蛋白的三級結構預測利用在線軟件SWIWW-MODEL預測并建立布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的三級結構模型。其GMQW值為0.52，說明結果可信度高，預測OmpW家族蛋白為單聚體，屬于外膜蛋白家族，見圖7。

圖7 三級結構預測

2.8 OmpW家族蛋白的T、B細胞抗原表位預測通 過ABCPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）預測蛋白共有2 4個B細胞抗原表位，如2 0 4-219，66-81，144-159，78-93，169-184，35-50等。通過NetMHCcons-1.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service. php?NetMHCcons-1.1）預測蛋白的T細胞抗原表位（HLA-A*02:01），預測結果強結合肽4個，弱結合肽5個。

3 討論

革蘭氏陰性菌的外膜（outer membrane，OM）外部小葉存在脂多糖，因此是一種保護性屏障，能阻礙親水性和疏水性化合物的滲透。OMP是促進革蘭氏陰性菌攝取細胞生長和功能所必需的營養和其他分子的通道之一[4]，是一種革蘭氏陰性菌中的特殊蛋白質，通常具有一個跨膜結構域，是細菌存活和毒力發揮的關鍵，主要包括OmpA、OmpW等[2]。而外膜蛋白W（OmpW）屬于小外膜孔蛋白家族，由8股反向平行β折疊片形成的桶狀疏水通道[5]，相關研究表明OmpW家族蛋白與提高細菌應對各種環境壓力的能力緊密相關，如滲透作用[6]、氧化作用[7]、溫度變化及營養匱乏[8]等。同時，OmpW家族蛋白作為一種毒力因子編碼的蛋白，其在細菌體內合成增多通常表示細菌毒力的加強，可視為是一種重要的保護性抗原[9]，由于其在革蘭氏陰性菌中具有較高的保守性，在病菌感染和宿主免疫反應的激活方面起重要作用，應成為疫苗研發的重點關注對象。目前，關于大腸桿菌OmpW家族蛋白基因的研究較多，而對于布魯氏桿菌OmpW基因鮮有報道。有研究表明，布魯氏菌外膜蛋白免疫原性較好，可以刺激機體產生較強的免疫，可作為疫苗構建的候選物[10]，鑒于此，本研究對其進行生物信息學分析，以期為進一步研究布魯氏桿菌的疫苗研發提供理論 依據。

布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白分子式為C1136H1717N281O321，脂肪族指數為91.63，理論pI值為5.67，原子總數為3457，其氨基酸序列Ala（A）占12.3%，Gly（G）占10.6%。Arg+Lys、Asp+Glu總數分別為16和18，其不穩定系數為23.01，可以認為布魯氏桿菌外膜蛋白OmpW家族蛋白具有較好的穩定性。本研究發現，在該蛋白7～29位氨基酸處存在有一個跨膜結構域。本研究預測該蛋白在細胞中起著通道蛋白的作用。該蛋白有96.481%的概率存在信號肽，信號肽指引蛋白質轉移的方式有兩種，轉運后由三種信號肽酶進行切除，該蛋白存在的信號肽為常規的分泌通路和Ⅰ型信號肽酶。

蛋白質的磷酸化修飾與多種生物學過程密切相關，如DNA損傷修復、轉錄調節、信號轉導、細胞凋亡的調節等。布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白存在17個磷酸化位點，存在1個N-糖基化位點，沒有發現存在O-糖基化位點。該預測為進一步解析OmpW家族蛋白磷酸化在調控布魯氏菌轉錄與復制過程中的作用奠定基礎。

通過分析布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族的二級結構可以發現其折疊比例最高，蛋白質折疊機制一直是一項研究熱點，蛋白質的錯誤折疊可能導致新生肽鏈的降解或蛋白活性的消失，因此，我們猜測誘導布魯氏桿菌OmpW家族的錯誤折疊可以破壞其穩定性，降低殺死此菌的難度。

抗原表位的研究，擁有重要的意義和臨床應用價值。預測顯示布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族共有24個B細胞抗原表位，T細胞抗原表位（HLA-A×02∶01）有強結合肽4個，弱結合肽5個。該蛋白抗原表位較多，有一定的抗原性，可以作為潛在的布魯氏菌感染抗原候選分子，為研發布病新藥靶點及新型疫苗制備提供新的方向。

通過上述研究，我們有效實現了布魯氏外膜蛋白OmpW家族蛋白生物信息的預測分析。該蛋白質由227個氨基酸殘基組成，原子總數為3 457，等電點為5.67，整體表現為非親水性的穩定蛋白；該蛋白存在1個跨膜結構域；含有1個N-糖基化和17個磷酸化修飾位點； 二級結構中有鏈（Strand）13個、螺旋（Holix）2個、卷曲（Coil）16個。以上研究表明布魯氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白在細菌感染和宿主免疫反應的激活方面有著重要作用，為深入解析OmpW家族蛋白在布魯氏菌在侵染過程中發揮的作用及研發更加安全有效的布魯氏菌疫苗和臨床治療藥物提供了一定理論基礎。