富含ω-3多不飽和脂肪酸的磷脂酰絲氨酸制備工藝研究

廖妙飛，付萬冬，孫繼鵬，周宇芳，馬明珠，王家星，姚瑋，胡詩琦

(浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316021)

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)又稱絲氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸絲氨酸，存在于動物、高等植物及微生物的生物膜中。PS能夠調節腦內情緒神經傳輸遞質的激素水平，同時可以抑制血清中促腎上腺皮質激素和可的松等的水平，對抑郁癥病人的情緒紊亂、行為異常、焦慮及易怒等癥狀具有明顯的改善效果[1-2]，以及對因為腦營養不良、腦部損傷或遺傳性神經遞質數量下降所造成的小兒多動癥也有著優越的改善效果[3-5]。通過工藝研究可制備磷脂含量較高的南極磷蝦油[6]，且磷脂主要為磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)[7]，PC在總磷脂中的占比最高可達99.80%，而其中ω-3多不飽和脂肪酸(EPA、DHA)主要以磷脂形式存在即EPA/DHA型磷脂[8-9]。眾所周知，EPA、DHA作為特定的免疫營養素，具有抗氧化、抗炎、降低血糖及增加機體對胰島素的敏感性等作用。而且DHA 與PS在輔助改善記憶力和增強免疫能力功能方面存在相互配伍[10]。

目前商品化的PS主要從大豆中提取，常用的分離方法有吸附分離法、低級醇分離法、CO2超臨界萃取法及膜分離法等。近年來，通過酶改性法制備得到的PS產品越來越多，磷脂酶D能催化甘油C-3位頭部末端的磷酸酯鍵，并在一定條件下催化磷脂酰殘基與絲氨酸結合生成PS的單一磷脂產品。通過酶法改性獲得的PS具有反應條件溫和、速度快、副產物少、酶制劑作用部位準確等特點。2010年，中國將PS列入新資源食品名單，其原料就是大豆卵磷脂和L-絲氨酸，采用磷脂酶轉化反應后，純化濃縮，再經過二次純化，干燥后包裝制得[11]。本文以南極磷蝦油為原料，利用其中富含的EPA、DHA型磷脂，在磷脂酶D的作用下與L-絲氨酸發生轉酯反應，制得富含ω-3多不飽和脂肪酸的PS，即EPA/DHA型PS，并通過單因素和正交試驗得到最佳制備工藝條件，可進一步拓展南極磷蝦油的深加工利用技術，提高其附加值，為營養健康食品高新技術產業作貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷脂酶D(上海源葉生物科技有限公司)；南極磷蝦油(PC含量為60%，遼漁集團有限公司)；PS標準品(99%以上，Sigma-Aldrich)；PC標準品(98%以上，Sigma-Aldrich)；甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；異丙醇(色譜純，異丙醇)；正己烷(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；L-絲氨酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；CaCl2(國藥集團化學試劑有限公司)、冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司)、無水乙酸鈉(西隴科學股份有限公司)、乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)、丙酮(國藥集團化學試劑有限公司)、乙醚(國藥集團化學試劑有限公司)等均為分析純。

1.2 儀器與設備

全溫振蕩培養箱、旋轉蒸發儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、pH計、Agilent 8860氣相色譜儀等。

1.3 方法

1.3.1 PS的制備工藝流程

一定量的南極磷蝦油溶解于有機溶劑并將其作為有機相，將酶、絲氨酸溶解于緩沖溶液，并在緩沖溶液中加入一定量的CaCl2，以此作為水相，兩相分別預熱后混合，放入振蕩培養箱，于一定溫度下振蕩反應一定時間后，加入1 mol/L鹽酸將酶滅活；將反應混合物靜置，分離兩相，取有機相，加入2.5倍體積的氯仿，混勻后，靜置分層，取氯仿層進行減壓蒸餾，除去氯仿，得到富含ω-3多不飽和脂肪酸的PS產物。

1.3.2 PS檢測方法

采用Agilent 1260 高效液相色譜儀測定PS和PC。色譜條件：色譜柱為ZORBAX RX -SIL Columns(4.6 mm×250 mm)；以甲醇-水-冰醋酸(體積比79∶14∶0.23)為流動相A，以異丙醇-正己烷-流動相A(體積比45∶20∶27)為流動相B，按表1進行梯度洗脫；柱溫為37°C，用蒸發光散射檢測器檢測(條件：漂移管溫度60°C，載氣流量1.8 mL/min)，洗脫程序如表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient eluted program

標準曲線的繪制：將PS標準品溶解于氯仿/乙腈(體積比為7∶2)，配制成濃度分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的標準溶液，用0.22 μm濾膜過濾后，按照上述方法進行HPLC分析，以標準溶液濃度(mg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。

待測樣品中PS的定量分析：將待測樣品處理后，按照同樣的分析條件進行HPLC分析，從色譜圖中求得峰面積，根據PS標準工作曲線計算進樣濃度，從而計算待測樣品中PS的總質量。

式中，0.6表示南極磷蝦油中PC含量以60%計。

1.3.3 EPA、DHA檢測方法

參照GB/T 38095—2019《DHA、EPA含量測定——氣相色譜法》。

1.3.4 單因素試驗

按照PS的制備方法，設置3個重復水平的試驗，以PS得率為考察指標，以南極磷蝦油濃度10 mg/mL、絲氨酸與南極磷蝦油質量比6∶1、PLD添加量為55 U、反應溫度40℃為基礎，分別考察了有機相種類(正己烷、乙酸乙酯、乙醚)、反應溫度(35、40、45、50、55℃)、水相pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、有機相和水相體積比(0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1)、絲氨酸與南極磷蝦油質量比(2∶1、4∶1、8∶1、16∶1、24∶1、32∶1)，以及反應時間(1、2、4、6、8、10、12 h)等因素對 PS 得率的影響。

1.3.5 正交試驗

在1.3.4單因素試驗的基礎上，設計正交試驗L9(34)，并進行3個重復水平的試驗，根據試驗結果得出PS制備的最佳工藝條件。

表2 正交試驗因素水平表Tab.2 The factor level of orthogonal test

2 結果與分析

2.1 各因素對PS得率的影響

2.1.1 有機相種類

本研究采用有機相與水相兩相體系，以極性為指標，選取具有代表性的有機溶劑乙酸乙酯、正己烷、乙醚，與醋酸緩沖液混合形成兩相反應體系，表3為使用不同有機溶劑時PS的得率。由表3可知，當使用乙酸乙酯時，PS的得率最高；當使用正己烷時，兩相體系幾乎無反應；當使用乙醚時，PS得率較乙酸乙酯次之。綜合PS得率、有機溶劑沸點及毒性，優選乙酸乙酯作為本研究的有機溶劑。

表3 使用不同有機溶劑時PS的得率Tab.3 PS yield at different organic solvent

2.1.2 反應溫度

在一定的溫度范圍內，酶活隨反應溫度的遞增一般呈現先增加后減小的變化，酶活力最高點為其最適反應溫度。由圖1可以看出，在35～55℃ 的溫度范圍內，PS的最終得率相差不大，但觀察各溫度下PS得率隨時間變化的曲線可以看出，在 40℃下PS前4 h合成的速度最快，但與45℃反應溫度下到達反應平衡狀態的時間差別不大。在考慮能耗的情況下，在本試驗研究條件中磷脂酶D催化合成 PS 的最適反應溫度為40℃左右。

2.1.3 水相pH值

水相pH值對PS得率的影響，主要是通過影響酶活性部位基團離子化程度和三維結構的共價鍵發揮作用。在反應體系中，酶具有催化底物磷脂進行兩種酶促反應的活性：一種是磷脂的水解，產生磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)；另一種是磷脂酰基轉移反應，生成PS。不同pH值對PS得率的影響如圖2所示，當pH在3.5～5.5之間時，PS得率呈現先增大后減小的趨勢；當 pH為4.5時，PS 的得率達到最大，說明此時酶的轉酯活性達到最大。

2.1.4 有機相與水相體積比

兩相體積比對PS得率的影響如圖3所示。兩相反應體系中，PS得率隨著有機相與水相體積比的增大呈現先增加后減少趨勢；當兩相體積比小于1∶1時，隨著有機相體積比例的增加，酶與磷脂接觸幾率增大，PS得率增加；當兩相體積比達到1∶1時，PS得率達到最大；隨著有機相比例繼續增大，PS得率開始下降，這可能是由過高的有機相比例影響磷脂酶的活性導致的。

2.1.5 絲氨酸與南極磷蝦油質量比

絲氨酸與南極磷蝦油質量比對PS得率的影響如圖4所示。由圖4可知，在絲氨酸與南極磷蝦油質量比小于16∶1時，PS得率隨著絲氨酸含量的增加而增大，這是因為此時作為底物的絲氨酸的含量的增加對轉酯反應的發生具有促進作用；當兩者質量比達到16∶1時，PS得率達到最大值，且再提高絲氨酸比例也不再變化，說明此時南極磷蝦油中磷脂與酶形成的復合物已經全部被絲氨酸飽和。因此，絲氨酸與南極磷蝦油質量比選擇16∶1為宜。

2.1.6 反應時間

反應時間對PS得率的影響如圖5所示。隨著反應的進行，PS得率迅速增加，隨后趨于平緩；當反應進行8 h后，PS得率基本不再變化，說明此時底物轉酯反應基本停止。因此試驗反應時間選擇8 h為宜。

2.2 正交試驗結果

由單因素結果可知，水相pH值、反應溫度、有機相與水相的體積比、反應時間對PS得率有較大的影響，因此選擇這4個因素設計正交試驗，結果如表4所示。

表4 正交試驗結果Tab.4 The orthogonal test results

由表4中極差R值可知，各因素對PS得率的影響大小為水相pH值>反應時間>有機相與水相的體積比>反應溫度，但方差分析顯示，4個因素對制備PS得率的影響均不顯著(表5)。本試驗結果以PS得率為指標，數值越大越理想，比較表4中4個因素的K1、K2、K3大小，K值最大對應的水平即為最佳水平，因此最佳因素水平組合為A2B2C2D2，即pH 4.5、反應溫度40℃、有機相與水相的體積比1∶1、反應時間8 h。因此，制備PS的最佳工藝條件為水相pH 4.5、有機相水相體積比1∶1、反應溫度40℃、加酶量55 U、絲氨酸與南極磷蝦油質量比16∶1、反應時間8 h。在此條件下進行3次重復試驗，PS得率均值為85.62%(標準偏差S=0.16)，產物中EPA含量為24.33%(標準偏差S=0.13)，DHA含量為19.95%(標準偏差S=0.12)。

表5 方差分析表Tab.5 Variance analysis

3 討論

PS作為一種新資源食品，其制備工藝的研究引起較多相關人員的重視，且大多是以大豆磷脂和L-絲氨酸為底物，開展兩相體系中酶法制備及純化工藝的研究[12-14]，如朱世斌[15]以蛋黃卵磷脂為底物開展酶法制備研究、王煥[16]以椰子油替代兩相反應體系中的有機溶劑開展相關研究；總體來說，PS的制備過程中兩相反應體系中有機溶劑種類、pH值、反應時間、反應溫度、有機相與水相的體積比、物料質量比等因素對得率均有較大的影響。也有研究人員嘗試其他制備工藝，如秦鑫鑫等[17]等以超臨界CO2為非水反應介質，利用磷脂酶A1和磷脂酶D催化制備富含DHA的南極磷蝦PS，但此研究有兩步催化反應，工藝較為復雜，且需要超臨界設備才能實現；杜陽吉[18]則是開展單一水相法催化合成PS的工藝研究，在單一水相中，磷脂酶有很高的水解活性而轉酯活性較低，導致最終反應體系中PS的含量僅為15.78%。

本研究中，在有機溶劑種類選擇方面，由表3數據可以看出：不同極性有機溶劑作用下PS的得率有所不同，這可能是由于有機溶劑極性影響兩相中底物與產物的分配與擴散，從而使反應的平衡常數和速率常數發生變化；其次，不同極性的有機溶劑與酶接觸后，對維持酶蛋白活性構型的氫鍵、疏水鍵的影響不同，從而導致PS得率有所不同。一方面，乙酸乙酯、乙醚、正己烷三種有機溶劑的極性依次減小，溶劑極性越小，疏水性越強，雖然南極磷蝦油磷脂在正己烷中有較大的溶解度，但正己烷強大的疏水性使其很難進入磷脂酶D的必需水層進行反應。另一方面，溶劑極性越強，越容易奪取酶分子的結合水，對酶活力的影響越大，因此乙酸乙酯對酶活力的影響大于乙醚和正己烷。在這兩方面影響的共同作用下，對比表3數據可知，以正己烷為有機溶劑的兩相反應體系的PS得率最低。

磷脂酶D的最適溫度和pH值受其來源影響較大，大多數最適催化溫度為25～45℃；微生物來源的磷脂酶D最適 pH 在4～8之間，植物來源的在5～6之間。本試驗中磷脂酶D的最適溫度為40℃、pH為4.5，在此條件下兩相體系中轉酯反應和水解反應同時進行，水解反應副產物 PA會影響目標產物 PS 的生成，此時兩相體積比、底物質量比顯得尤為重要。兩相體積比主要是對水相中的酶與有機相中底物的接觸概率產生影響，有機相與水相體積比的增加提高了PS得率，當體積比繼續增大時，雖然底物和磷脂酶 D 的接觸概率提高，但酶更容易與有機溶劑接觸而使活性降低，因此 PS 得率逐漸下降。底物質量比則是通過影響反應的化學平衡及與酶的配比，從而影響反應結果。當絲氨酸與酶同處于水相時，作為親核試劑的絲氨酸首先進入酶活性中心，絲氨酸比例的增加形成了更多的絲氨酸-酶復合物，從而提高了PS得率，當絲氨酸達到一定量后，酶活性中心全部被絲氨酸飽和，PS得率達到最大值。

本研究通過單因素和正交試驗，獲得富含ω-3多不飽和脂肪酸的PS最佳制備工藝條件：水相pH 4.5、有機相和水相體積比1∶1、反應溫度40℃、加酶量55 U、L-絲氨酸與南極磷蝦油質量比16∶1、反應時間8 h，在此條件下，PS得率為85.62%，其中EPA含量為24.33%，DHA含量為19.95%。