解偶聯蛋白2的表達與結直腸癌患者臨床病理特征和預后的關系

任燕珍, 李蕊仙, 陳建娥, 杜志超, 婁玉華

(內蒙古錫林郭勒盟中心醫院, 1. 腫瘤科, 2. 藥劑科, 3. 預防保健科, 內蒙古 錫林浩特, 026000)

近年來，結直腸癌的發病率呈逐年增長趨勢，患者患病早期無法及時就診是致死的主要原因[1-3]。線粒體解偶聯蛋白之一的解偶聯蛋白2(UCP2)是一種線粒體內膜蛋白，可以發揮介導離子滲透、影響ATP合成、參與體內脂代謝、調控細胞內活性氧(ROS)等多重作用。研究[4-5]已證實, UCP2可在多種腫瘤中均呈異常表達，其主要通過減少細胞凋亡、促進增殖等方式參與腫瘤的發生與發展過程。UCP2在結直腸癌中的表達與其臨床病理特征和預后結局的關系尚不明確，相關研究較少。本研究通過免疫組織化學法檢測結直腸癌及癌旁正常組織UCP2表達水平，探討UCP2表達與結直腸癌患者臨床病理特征、預后的關系以及預后的影響因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準: ① 符合臨床結直腸癌的診斷標準者; ② 術后標本均通過病理診斷確診為結直腸癌[6]者; ③ 術前采用放化療治療者; ④ 患者淋巴結轉移、腫瘤直徑等臨床資料完整。排除標準: ① 有腦血管、心血管病、糖尿病以及肝、腎功能衰退等原發性疾病臨床癥狀者; ② 患有老年癡呆癥或者精神異常導致臨床信息收集數據可信度不高者; ③ 有腫瘤癥狀的患者; ④ 有長期飲酒、吸煙等不良生活習慣并誘發肝臟功能衰竭者。根據隨機抽樣法以及納入、排除標準，選取 2018年1月—2021年1月采用根治性切除術治療的結直腸癌患者160例為研究對象。以世界衛生組織有關結直腸癌疾病診斷標準對患者進行診斷，參與實驗的患者對本研究知情，研究經倫理委員會批準。結直腸癌患者中，男114例，女46例，年齡23～85歲，平均(60.33±4.55)歲。按腫瘤分化程度將其分為低分化患者50例和高分化患者110例。根據國際抗癌聯盟(UICC)和美國癌癥聯合會(AJCC) 制定的TNM分期系統(2017年第8版), 160例患者中, Ⅰ期患者14例, Ⅱ期患者46例, Ⅲ期患者100例。84例淋巴結轉移結果呈陰性, 76例結果呈陽性，患者體力未出現明顯下降，生活可自理。剔除標準: ① 研究期間因工作調動等個人原因到其他省市生活、工作者; ② 自身出現嚴重疾病需轉入其他科室進行進一步治療者; ③ 不愿配合研究的患者。出現以上任意1種情況均納入病例剔除范圍，刪除病例的相關資料，不再補充其他病例。直至研究數據收集完成，本研究未出現病例剔除情況。

1.2 方法

取所有研究對象手術切除的部分結直腸癌組織及其癌組織5 cm以外的癌旁正常組織送至相關科室檢驗。所有患者結直腸癌組織以及癌旁正常組織的標本均采用濃度為10%的福爾馬林溶液進行固定，之后通過石蠟包埋以及制片等措施處理為厚度為4 μm的切片，分別進行蘇木精-伊紅染色(HE)染色以及免疫組織化學染色。從患者組織標本切片中選取4片進行染色, 1片用于HE染色, 3片用于免疫組織化學染色，并加入特異性單克隆抗體抗UCP2抗體。

1.2.1 HE染色: 將制成的切片利用二甲苯進行常規脫蠟，持續處理10 min, 并重復1次操作，之后按照100%、100%、95%、90%、85%的濃度分別進行酒精水化，每個濃度持續1 min, 之后利用自來水進行反復沖洗。應用蘇木精染液對細胞核進行染色，持續15 min, 之后用自來水沖洗1 min。加入濃度為1%的鹽酸酒精溶液進行細胞分化，持續反應20 s后置于自來水下沖洗1 min; 應用濃度為1%的稀氨水進行反藍處理，持續30 s后置于自來水下沖洗1 min; 使用0.5%的伊紅水溶液對胞質進行染色，持續3 min后脫水處理，按照85%、90%、95%、100%的濃度依序脫水，脫水時間分別為20 s、30 s、1 min、2 min, 每個濃度重復2次操作。使用二甲苯進行透明處理，持續2 min, 該操作重復3次后應用中性樹膠進行封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學實驗: 將制成的石蠟切片利用二甲苯進行常規脫蠟，持續處理10 min, 并重復操作1次，之后按照100%、100%、90%、80%、70%的濃度梯度進行酒精水化，每個濃度持續2 min; 采用雙蒸水反復沖洗后使用免疫組化筆在切片上劃取染色范圍; 將濃度為3%的雙氧水加至切片上，并在恒溫環境中靜置10 min, 以達到抑制內源性過氧化物酶活性的目的，并使用PBS溶液反復沖洗3次以上，每次持續2 min; 在pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中放置切片, 95～98 ℃溫度下微波爐加熱，持續10 min后完成抗原修復，并在恒溫環境中冷卻20 min。加入正常山羊血清進行封閉處理，在恒溫環境中靜置15 min后丟棄山羊血清，注意不可沖洗，之后加入一抗，在37 ℃溫度下進行孵育，持續15 min后利用PBS溶液反復沖洗3次以上，每次持續5 min; 加入辣根酶標記鏈霉卵白素，在37 ℃條件下進行孵育，持續15 min后利用PBS溶液反復沖洗3次以上，每次持續5 min; 各取1滴試劑盒中的A、B、C試劑，加入1 mL雙蒸水，配置成底物染液DAB, 在切片上加上DAB, 直至出現棕色沉淀，使用雙蒸水進行沖洗; 再次用蘇木精溶液進行染色，自來水沖洗后進行脫水，按照70%、80%、90%、100%、100%的濃度梯度依序脫水，各濃度的脫水時間均為2 min, 每個濃度重復操作2次，之后使用二甲苯進行透明處理，持續1 min, 該操作重復2次后應用中性樹膠進行封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組織化學檢測結果判定: 染色結果統一由2名具備多年免疫組化實驗經驗的臨床醫師進行評估判斷，評判前不得向臨床醫師透露任何關于患者的病歷資料, UCP2蛋白以細胞質作為主要分布區域，性狀為棕黃色顆粒。臨床醫師根據統一的判定標準對染色結果進行評判，評判過程需重復3次以上。隨機從高倍鏡下選取10個視野，分別計數100個，應用精準度較高的半定量法完成該步驟，之后對染色結果中的陽性強度以及陽性細胞占比情況進行評分，具體評分標準如下。以背景色為參照評判陽性細胞的染色強度，無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分; 以陽性細胞占比情況進行評估，若結果為陰性則記0分，若陽性細胞占比為25%以下記1分，若陽性細胞占比為25%～50%記2分，若陽性細胞占比>50%～75%記3分，若陽性細胞占比超過75%記4分。將陽性細胞占比分值與染色強度分值相加，若總分值為≤1分則為陰性，用(-)表示; 若分值為2～3分同樣記為陰性，用(±)表示，若分值為4～5分記為弱陽性，用(+)表示; 若分值6～7分記為強陽性，用()表示[7]。≤1分和2～3分均記為陰性, 4～7分均記為陽性。

1.2.4 隨訪方法: 對所有患者進行為期1年的隨訪，記錄患者基因突變情況、化療情況以及體力情況。

1.3 觀察指標

① 比較UCP2在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達水平; ② 采用單因素分析探討UCP2在結直腸癌組織中的表達水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況等臨床病理特征的關系; ③ 比較UCP2不同表達的結直腸癌患者的總生存率和無病生存率的差異; ④ 采用單因素分析探討UCP2蛋白的表達與患者預后的關系; ⑤ 采用多因素Logistic回歸分析模型分析結直腸癌患者預后的影響因素。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行統計學分析。繪制Kaplan-Meier生存曲線分析患者1年累積生存率; 采用多因素Logistic回歸分析模型對總體1年生存率及預后危險因素進行評估分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 UCP2在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達

細胞質是UCP2蛋白表達的主要區域(圖1), 免疫組化染色顯示深淺不一，主要呈棕黃色或黃色顆粒，強陽性的細胞質中出現多處棕黃色顆粒，陰性細胞質中的棕黃色及黃色顆粒較少。UCP2在結直腸癌組織中的表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(χ2=158.505,P<0.01)。UCP2在癌旁正常組織中表達均為陰性, UCP2在結直腸癌組織中表達呈陽性106例(66.25%), 陰性54例(33.75%)。

A: UCP2在癌旁正常組織中陰性表達; B: UCP2在結直腸癌組織中陽性表達; C: UCP2在結直腸癌組織中陰性表達。圖1 HE染色檢測結直腸癌組織及癌旁正常組織中UCP2的表達情況(放大倍數400倍)

2.2 UCP2在結直腸癌組織中表達水平對臨床病理特征的影響

不同年齡、性別、腫瘤直徑患者UCP2陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。低分化結直腸癌組織中UCP2蛋白表達水平高于高分化結直腸癌組織，差異有統計學意義(P<0.01); TNM分期為Ⅲ期的患者癌組織中的UCP2陽性表達水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，差異有統計學意義(P<0.01); 淋巴結轉移患者癌組織中UCP2的陽性表達率高于淋巴結未轉移患者，差異有統計學意義(P<0.01), 見表1。

表1 UCP2蛋白的表達與結直腸癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 UCP2蛋白表達與患者預后的關系

UCP2陽性表達的結直腸癌患者的1年總生存率、1年無病生存率低于UCP2陰性表達的結直腸癌患者，差異有統計學意義(χ2=8.12,P=0.03;χ2=9.55,P=0.03), 見圖2、圖3。

圖2 不同UCP2表達的結直腸癌患者的1年總生存率生存曲線

圖3 不同UCP2表達的結直腸癌患者的1年無病生存率生存曲線

2.4 UCP2蛋白表達與患者預后關系的單因素分析

單因素分析結果顯示，不同腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴轉移、UCP2表達的結直腸癌患者1年生存率比較，差異有統計學意義(χ2=6.13,P=0.01;χ2=40.80,P<0.01;χ2=7.01,P=0.01;χ2=8.12,P<0.01), 見表2。

表2 影響結直腸癌患者預后的單因素分析

2.5 UCP2蛋白表達與患者預后關系的多因素分析

將單因素分析中P<0.05的變量作為自變量代入結直腸癌患者預后結局的多因素回歸分析模型中，腫瘤分化(0=高分化, 1=低分化)、TNM分期(0=Ⅰ期、Ⅱ期, 1=Ⅲ期)、UCP2表達(0=陰性, 1=陽性)、淋巴結轉移(0=未轉移, 1=轉移)。預后1年生存率結果顯示，結直腸癌患者預后結局的獨立危險因素包括腫瘤分化(低分化)、TNM分期(Ⅲ期)、淋巴結轉移、UCP2陽性表達, 見表4。

表4 結直腸癌患者預后臨床因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

UCP2是一種陰離子轉運體蛋白，分布于線粒體內膜，可以誘發質子滲漏并對膜兩側的電化學梯度造成破壞，進而降低線粒體膜電位，氧化磷酸化過程解偶聯，抑制三磷酸腺苷的合成, UCP2在體內多種器官中廣泛分布，其主要參與細胞生理進程[8]。多項研究[9-10]結果顯示，頭頸部、胰腺、前列腺與結直腸腫瘤中UCP2表達水平較高，易發生淋巴結轉移。本研究免疫組織化學法結果顯示, UCP2在結直腸癌組織、癌旁正常組織中陽性表達率存在顯著差異，其作用機制如下。線粒體以氧化磷酸化方式產生能量，線粒體內膜上的ATP合酶是氧化磷酸化的關鍵，而UCP2作為一種陰離子轉運體，可以跨線粒體內膜，無需通過ATP合酶途徑回流，可以形成調控解偶聯ATP生成與氧化磷酸化過程的質子漏，過程中釋放的能量以熱量形式散失，并未用于ATP合成過程，線粒體內膜電勢下降、還原狀態的中間產物時間縮短以及超氧陰離子生成率下降等現象均與UCP2介導質子引發滲漏有關聯，進一步導致ROS生成率受調控呈負性增長，氧化應激反應減弱，增強腫瘤細胞缺氧、化療藥物耐受性，以此達到保護腫瘤細胞的目的，下調UCP2的表達可以抑制腫瘤的形成，提示UCP2在腫瘤的形成初級階段可能扮演著極為重要的角色[11]。

本研究結果顯示，低分化、TNM期為Ⅲ期、有淋巴結轉移的結直腸癌組織中UCP2的蛋白表達水平更高，原因可能是UCP2參與腫瘤細胞的能量代謝，UCP2上調抑制線粒體氧化磷酸化過程，增強Warburg效應與促進糖酵解反應能量的產生，進而促進了腫瘤細胞的增殖和遷移，造成淋巴結轉移、TNM分期增加以及分化程度降低等，進一步證實UCP2陽性表達可以發揮促進腫瘤轉移的作用，同時也說明UCP2蛋白表達在腫瘤發展進程中具有顯著作用[12-13]。

李秋妍等[14]在對乳腺癌進行臨床研究時同樣發現，UCP2的高表達與預后效果不理想有關。蔣滟蘄等[15]研究顯示, UCP2 rs659366位點基因多態性可能是影響結直腸癌術后患者生存結局的因素，腫瘤部位(結腸、直腸)、TNM分期等與患者的生存結局相關，其機制可能是原發腫瘤浸潤深度增加會使根治難度相應增大，而UCP2 rs659366位點A等位基因可以通過結合配對盒基因6(Pax6)增強啟動子活性，促使UCP2轉錄過程加快，提高UCP2蛋白的表達水平, UCP2蛋白過表達會抑制結直腸癌組織產生ROS, 對部分通過ROS途徑起效的藥物的抗癌療效造成影響，最終增大結直腸癌患者發生不良預后的風險。本研究還發現, UCP2陽性表達的結直腸癌患者的1年總生存率和1年無病生存率較低，不同腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴轉移、UCP2表達的結直腸癌患者的1年生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05); 多因素回歸分析證明，腫瘤分化(低分化)、TNM分期(Ⅲ期)、UCP2陽性表達、淋巴結轉移是影響結直腸癌患者預后的危險因素，分析原因可能是腫瘤容易侵及鄰近組織并引發遠處轉移，腫瘤組織細胞間的黏附性減弱以及細胞運動、侵襲性能力增強會造成細胞的無限繁殖，增加氧氣能量的消耗形成腫瘤組織低氧環境，增大腫瘤細胞轉移復發以及病情惡化風險，導致組織低分化、TNM分期增加、淋巴結轉移、UCP2高表達，進而增加死亡等預后不良風險。結合以上結果與UCP2的機制分析, UCP2有可能會作為媒介使腫瘤組織對化療藥物產生耐藥性，因此腫瘤細胞UCP2高表達會降低患者對順鉑的敏感度，產生耐藥性，進而降低化療效果，不利于患者病情的控制，促進腫瘤患者病情快速進展，繼而發生腫瘤組織低分化、淋巴結轉移、TNM分期增加等，對患者預后不利，以上均證明UCP2陽性表達可能是結直腸癌患者預后不理想的危險因素, UCP2今后能夠作為預測結直腸癌患者生存預后的重要標識。

綜上所述, UCP2在結直腸癌患者癌癥組織中呈高表達，與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移等存在密切關系, UCP2的高表達同時證明結直腸癌患者的預后效果不佳，可將研發UCP2的有效抑制劑作為治療結直腸癌的新方向。