橡膠樹耐低溫評價及爆皮流膠差異性比較

程琳琳，安 鋒，謝貴水，王紀坤，彭文濤，周立軍

(1. 中國熱帶農業科學院橡膠研究所, 海口 571101；2. 海南儋州熱帶農業生態系統國家野外科學觀測研究站, 海南 儋州 571737)

【研究意義】巴西橡膠樹[Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.]，以下簡稱橡膠樹,原產地的生長環境造就了其對高氣溫的要求。雖然，我國在橡膠樹北緣栽培中取得了卓越的成就，但是由于冬春季受寒潮及冷空氣的影響，寒害仍是橡膠樹栽培與發展的限制性因子[1]。橡膠樹在不同類型的寒害情況下，主要表現為枝葉干枯、莖干黑斑、樹體各部位爆皮流膠等受害癥狀[2]。因寒害導致的莖干爆皮流膠不僅會導致樹皮潰爛壞死，還會引起后期小蠹蟲、病原菌的入侵，造成寒害后的次生病蟲害，致使橡膠樹的抗逆性下降，并可加重因寒害造成的經濟損失[3-4]。因此，探索不同橡膠樹品種耐寒性及低溫所致爆皮流膠的差異對于橡膠樹抗寒栽培管理措施的實施以及爆皮流膠機制研究至關重要。【前人研究進展】近年來，以生理指標反映橡膠樹耐寒能力的應用較為廣泛。李玲等[5]低溫脅迫2個橡膠樹品種芽接苗，測定其電導率并進行恢復，根據2個品種低溫下表現及不同組織電導率的變化情況，確定了較為抗寒的品種。孔廣紅等[6]以低溫脅迫下，葉片活性氧相關成分含量、抗氧化相關物質含量及酶類活性高低來反映橡膠樹耐寒與非耐寒品種間的差異。結合隸屬函數法及主成分分析法分析低溫下橡膠樹不同品種(系)的生理指標差異，不僅可以比較不同品種(系)自然低溫下的抗寒能力[7-9]，而且可以判斷人工模擬不同類型寒害條件下，不同橡膠樹品種的耐寒性強弱[10]。【本研究切入點】由于自然及人工模擬低溫條件下，橡膠樹幼苗極少發生爆皮流膠寒害癥狀[11]，所以將低溫下生理生化指標與爆皮流膠情況的差異相結合來研究橡膠樹不同品種寒害與爆皮流膠的耐受性鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究選擇熱研7-33-97、熱研7-20-59、湛試327-13、93-114等4個橡膠樹品種一年生芽接苗為材料，結合設置的人工模擬低溫條件，測定低溫下其葉片葉綠素熒光參數和部分生理生化指標的變化差異，通過隸屬函數法、主成分分析法對其耐寒性進行比較，并結合低溫條件所致爆皮流膠的情況分析，以期探索橡膠樹爆皮流膠耐受性的機制，為完善橡膠樹抗寒評價體系和抗寒栽培技術研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為國家熱帶植物種質資源庫—橡膠樹(National Tropical Plants Germplasm Resource Center-Rubber Tree)提供的一年生芽接苗(2020年5月芽接，高度為0.8～1.0 m)，品種為熱研7-33-97、熱研7-20-59、湛試327-13及93-114。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設計 選擇長勢基本一致的4個橡膠樹芽接苗(每個品種20株)品種，放置于人工氣候室內進行低溫脅迫處理。在低溫脅迫的第0、2、4、6天測定各品種各植株相同部位葉片的葉綠素熒光參數和生理生化指標，0 d作為對照。低溫脅迫6 d后，在人工氣候室內恢復1周，將所有植株移入自然環境中。從植株開始出現流膠癥狀時至移入自然環境條件前，記錄每個品種流膠情況。在移入自然環境55 d后，統計其存活情況。低溫脅迫期間人工氣候室的控制條件為：12 h光照，12 h黑暗，相對濕度為80%；光照強度為75～100 μmol/(m2·s)；光照時段溫度控制在(16±1)℃，黑暗時段溫度控制在(4±1)℃。恢復期間控制條件為：除溫度控制在(26±1)℃之外，其他同于低溫脅迫時情況。

1.2.2 測定方法 采用WALZ PAM-2500便攜式葉綠素熒光儀測定葉片最大光化學效率(Fv/Fm)。各時間梯度生理指標測定時各品種各植株至少選擇2個葉片，各品種各時間梯度至少選取3個植株的葉片，各品種各時間梯度的葉片混合后設置3個重復。參照李小琴等[8]的方法，采用METTLER TLEDO-FE38電導率儀測定電導率。葉綠素含量采用混合液法[12]測定。采用蘇州科銘生物技術有限公司的試劑盒測定橡膠樹植株葉片可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量、SOD活性。采用廣陸數顯游標卡尺(111N-101-10G)測定橡膠樹芽接苗流膠情況(點狀流膠測流膠點的直徑，條狀流膠測流膠的長度和寬度)后計算其面積。

1.3 數據處理

葉綠素熒光參數及生理生化指標數據為3次重復的平均值，采用Excel和DPS進行數據統計與分析，多重比較采用Duncan’s新復極差法，用OriginPro 2018進行繪圖；用隸屬函數法[13]對4個橡膠樹品種芽接苗進行耐寒性比較，用IBM SPSS軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下不同品種葉片生理生化指標的變化

2.1.1 相對電導率和丙二醛含量 由圖1-A可知，低溫脅迫的過程中，4個橡膠樹品種與各自對照相比，相對電導率均增加，各品種相對電導率呈先升高后下降趨勢。但是，有別于熱研7-20-59、湛試327-13和93-114 3個品種相對電導率逐步升高而后下降趨勢，熱研7-33-97相對電導率表現為陡然升高后逐步降低，它在第2天的相對電導率比其對照升高69.31%，均高于熱研7-20-59、湛試327-13和93-114 3個品種的27.80%、17.84%和40.10%；而后在第4～6天，熱研7-33-97相對電導率與其對照相比，變化幅度均小于其他3個品種。在低溫過程中，熱研7-33-97相對電導率均顯著高于熱研7-20-59。

數值為3個數值的平均值，誤差棒為標準差，小寫字母表示相同時間梯度下品種間存在顯著差異(P<0.05)

2.1.2 可溶性糖和可溶性蛋白含量 如圖1-C所示，在受低溫的過程中，除熱研7-33-97可溶性糖含量為“升—降—升”趨勢外，另外3個品種的可溶性糖含量均為先降后升趨勢。脅迫4～6 d的過程中，4個品種可溶性糖含量均低于其對照。低溫下，湛試327-13可溶性糖含量最高，而且變化幅度也是最小，與其對照相比，其降低幅度僅為0.08%、8.78%和5.43%，均低于其他3個品種。在脅迫的4～6 d，4個品種間可溶性糖含量的差異均達到顯著水平(P<0.05)，湛試327-13和93-114的可溶性糖含量均高于熱研7-33-97和熱研7-20-59。

由圖1-D可以看出，受低溫的影響，4個品種可溶性蛋白含量變化的趨勢不一致：熱研7-33-97和93-114呈“降—升—降”趨勢，在低溫的第4天，熱研7-33-97和93-114的可溶性蛋白含量增幅均較大，熱研7-33-97可溶性蛋白含量與其對照相比，增幅為20.12%，93-114與其對照相比，增加12.43%；熱研7-20-59呈先降后升趨勢，與其對照相比，可溶性蛋白含量均降低；湛試327-13呈先升后降趨勢，在低溫的第2天，可溶性蛋白含量增加，后期又呈現逐步下降趨勢。

2.1.3 超氧化物歧化酶活性 如圖1-E所示，低溫條件下，4個品種的超氧化物歧化酶活性的變化趨勢保持一致，均為先升高后下降的趨勢。低溫條件的第2天，與各自對照相比，熱研7-33-97、熱研7-20-59、湛試327-13、93-114超氧化物歧化酶活性增幅最大，分別為其對照的2.11倍、3.10倍、26.09%、1.75倍。低溫條件的第6天，雖然93-114超氧化物歧化酶活性有所下降，但是與其對照相比，其變化幅度仍然增加，而其他3個品種與各自對照相比變化幅度均降低。同時，除了低溫脅迫的第4天，其他時間梯度，4個品種超氧化物歧化酶活性的差異均達到顯著水平(P<0.05)。

2.1.4 葉綠素含量 由圖1-F、1-G、1-H可見，低溫脅迫下，熱研7-33-97葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量為先升高后下降的趨勢，低溫的第4天，其值最高。熱研7-20-59葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量一直呈現逐步增加的趨勢，可能是低溫逆境下葉片失水所致，但是其含量均顯著低于其他3個品種。湛試327-13 葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量均呈“降—升—降”趨勢,低溫的第4天，其葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量最高。93-114葉綠素a、葉綠素總量呈先升后降趨勢，而葉綠素b含量呈“升—降—升”趨勢，低溫脅迫的第2、6天，其葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量最高。與其對照相比，93-114葉綠素a含量、葉綠素總量增加幅度均高于其他3個品種，分別為60.13%、28.53%、27.50%和56.50%、25.50%、25.26%。

2.1.5 PSII最大光化學效率 由圖1-I可得知，隨著低溫時間的延長，4個品種的PSII最大光化學效率呈逐步下降的趨勢，熱研7-33-97、湛試327-13和93-114的PSII最大光化學效率均高于熱研7-20-59，其差異達到顯著水平(P<0.05)。與各自對照相比，熱研7-33-97的 PSII最大光化學效率降低幅度分別為0.28%、2.42%、6.17%，均小于熱研7-20-59的5.08%、6.96%、9.09%；93-114 的 PSII最大光化學效率降低幅度分別為1.06%、1.61%、2.60%，均小于湛試327-13的2.33%、5.78%、5.87%。

2.2 隸屬函數法比較橡膠樹品種耐寒性差異

采用隸屬函數法對4個橡膠樹品種低溫脅迫下各項生理生化指標分別進行計算，比較其耐寒性。由表1可以看出，4個品種的平均隸屬度從大到小的排序為： 93-114>湛試327-13>熱研7-33-97>熱研7-20-59，但是93-114 和 湛試327-13的差值并不大。

表1 不同品種生理生化指標隸屬函數值及平均隸屬度

2.3 主成分分析法比較橡膠樹品種耐寒性差異

對4個橡膠樹品種生理生化指標進行主成分分析，其結果見表2。由主成分分析結果可以看出：前3個主成分的特征值分別為5.330、2.086和1.584，貢獻率分別為59.226%、23.173%和17.600%，前3個主成分的累計貢獻率為100%，可以反映低溫脅迫下橡膠樹生理生化指標的全部信息。由表3可以看出：第1主成分中，具有較高荷載的為葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素總量及最大光化學效率；第2主成分中，具有較高荷載的為可溶性糖含量、SOD活性和相對電導率；第3主成分中，具有較高荷載的為可溶性蛋白含量。

表2 主成分特征值及累計貢獻率

表3 主成分荷載矩陣

根據主成分分析結果，可得出3個主成分函數表達式。

果然周副書記很老到，他說，我帶你到幾個部門走走。幾天來，周書記馬不停蹄地帶到我找電力、稅務、銀行、火車站等部門單位化緣，又找到鎮上很有些實力企業老板拉了些贊助，五萬元的經費基本上沒問題。

Y1=0.264X1+0.078X2-0.217X3+0.428X4+0.429X5+0.429X6+0.392X7+0.370X8+0.189X9

Y2=-0.456X1+0.158X2+0.600X3+0.096X4+0.090X5+0.094X6+0.289X7-0.240X8+ 0.491X9

Y3=-0.352X1+0.760X2-0.007X3-0.050X4+0.021X5-0.030X6+0.068X7+0.031X8-0.439X9

由3個主成分函數表達式，分別計算出4個品種耐寒性的綜合得分值：Y=0.592Y1+0.232Y2+0.176Y3。由表4可知，低溫脅迫下，不同橡膠樹品種主成分綜合得分排序為：93-114 >湛試327-13>熱研7-33-97>熱研7-20-59。

表4 不同橡膠樹品種主成分得分及排序情況

2.4 不同橡膠樹品種爆皮流膠差異性比較

在低溫脅迫的第4天，橡膠樹芽接苗植株開始出現爆皮流膠癥狀。流膠產生于植株綠色莖干的葉痕、芽眼、節間等位置，或者出現在總葉柄、總葉柄的葉枕、腋芽處。與此同時，熱研7-33-97和湛試327-13植株莖干流膠伴隨出現黑斑；熱研7-33-97和93-114葉片出現黑斑。由表5可以看出，低溫脅迫下，熱研7-20-59流膠植株數最多，熱研7-33-97最少。橡膠樹各品種總流膠個數與植株存活率情況與隸屬函數法及主成分分析法得出的品種耐寒性保持一致；而流膠面積大小，即流膠量的大小與耐寒性并不一致，這可能與品種膠乳含量、干膠含量、總固形物含量等因素有關。

表5 不同橡膠樹品種流膠差異情況比較

3 討 論

在不利的溫度環境下，植物受影響最大的細胞器就是葉綠體，異常的環境溫度導致光合電子傳遞性能的降低及影響PSII，使得多余能量產生一系列活性氧，光合作用和葉綠素合成均因活性氧受到抑制。活性氧不僅影響氧化還原信息轉導，而且它的積累會對細胞產生毒害[14]。作為評價光合能力的重要指標，葉綠素在收集、傳導、轉化、吸收光能中具有重要作用[15]，葉綠素減少會降低植物光保護的性能[16]。 另一方面，葉綠素的合成涉及一系列的酶促反應，過程較為復雜。環境溫度一旦下降，由于碳固定減慢，導致葉綠體中的“激發壓力”增加，庫容量就會減少[17]，葉綠素合成中相關催化酶活性也受影響，所以葉綠素合成與功能發揮受抑制程度存在差異，以致本研究中不同橡膠樹品種之間葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量變化也存在著差異。PSII最大光化學效率(Fv/Fm)常被用作植物逆境條件下抗性高低的重要指標[18]。當光能超過植物光合作用所需時，光合效率就會大幅下降，出現光抑制，尤其是在逆境下，植物的光抑制最為明顯[19]。本研究中，低溫脅迫下，熱研7-20-59的最大光化學效率均小于其他3個品種，也就意味著其對低溫最為敏感，4個橡膠樹品種的PSII受低溫的影響，其開放程度明顯降低，光合性能受到影響[20]。一旦植物受不利溫度的脅迫，葉綠體受損傷，導致光合電子傳遞性能降低及PSII受抑制，光能轉化為熱能，植物借助熱耗散消耗多余熱量，拮抗過剩能量對其本身的損傷，多余的能量就以活性氧的形式散發出來，致使細胞脂膜過氧化產生丙二醛，丙二醛的積累反過來加劇植物受損傷的程度[21]。隨著低溫脅迫時間的延長，與各自對照相比，4個橡膠樹品種葉片丙二醛(MDA)含量最終均達到顯著水平，也就意味著低溫對各品種植株細胞膜均造成了損傷[22]，細胞膜的透性就逐步增大，胞內電解質外滲隨之增加，即相對電導率上升[23]。在低溫下，4個橡膠樹品種植株葉片相對電導率與各自對照相比，其電導率均呈增加的趨勢，但后期由于活性氧清除系統所涉及的滲透調節物質及相關酶的作用，植物拮抗低溫逆境的防御功能逐步顯現。作為滲透調節物質之一，可溶性糖可維持細胞液的流動性與細胞功能的正常性，降低植物在低溫下的傷害[24]。在低溫環境下，湛試327-13植株葉片可溶性糖含量是最高的，而且變化幅度也是最小的。而且湛試327-13和93-114植株葉片可溶性糖含量均高于其他2個品種，所以其耐寒性與其可溶性糖含量較高是密不可分的。作為親水性膠質，可溶性蛋白可降低細胞冰點[25]，參與低溫逆境信號轉導、細胞修復調控等[26]，會隨著植物低溫馴化而升高[27]。本研究中，與各自對照相比，除了熱研7-20-59以外，其他3個橡膠樹品種葉片可溶性蛋白(SP)在低溫下均出現了增幅的峰值，所以可溶性蛋白積累在降低熱研7-33-97、湛試327-13和93-114 3個品種的滲透勢，提高它們的耐寒性方面起到了較好的作用。逆境下，SOD可清除植物細胞內產生的活性氧，維持細胞完整性[28]，從而提高植物的抗逆性[29]。低溫逆境中，SOD活性被激活，植物的耐寒性提高，植物產生了對低溫的自我保護能力，但是隨著低溫過程的延長，植物受低溫影響程度加大，SOD活性而逐步下降[30]，這與本研究中4個橡膠樹品種SOD活性的變化趨勢是一致的。

橡膠樹的根、莖、葉(葉片、小葉柄、大葉柄)中均存在產生膠乳的乳管，但在莖干中最多[31]。由此，本研究中4個橡膠樹品種在植株的莖干、葉部位均發生了爆皮流膠癥狀。不同品種乳管個數存在差異，膠乳濃度(干膠含量、總固形物含量)[32-33]和因植株營養情況而致的凝固酶的差異，導致其流膠性能的差異[31]。另一方面，受低溫脅迫的影響，可能由于細胞壁中纖維素、半纖維素和木質素等各組成成分在細胞壁中的分布、結合方式以及各組成成分本身的性能改變造成植物細胞壁及宏觀力學性能的改變[34]，以致于不同橡膠樹品種低溫下乳管破裂的方式以及破裂程度不同，最終導致4個橡膠樹品種流膠株數、流膠面積與其耐寒性并不完全一致。

以單一生理生化指標判斷植物的耐寒性較為困難，因為同一物種的不同品種之間的同一生理生化指標變化規律并不完全相同，以單一生理生化指標來判斷品種間的耐寒性勢必造成評判的片面性及結果的差異、不客觀性[35]。與此同時，由于橡膠樹耐寒性是較為復雜的數量性狀，而且對不同類型的低溫寒害的表現在品種間的差異較大[36]。因此，結合隸屬函數法、主成分分析法對本研究中的4個橡膠樹品種耐寒性進行綜合評價，可以避免單一生理生化指標評判的局限性和各指標信息的重疊性，使結果更加客觀、全面[37]。

4 結 論

本研究通過隸屬函數法、主成分分析法對低溫脅迫下4個橡膠樹品種葉片相對電導率、丙二醛含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、葉綠素含量及最大光化學效率等指標進行其耐寒性的綜合評價。結果表明，隸屬函數分析法與主成分分析法評價的耐寒性順序為：93-114 >湛試327-13> 熱研7-33-97>熱研7-20-59。因低溫導致的4個品種流膠株數的排序是：熱研7-33-97<湛試327-13 = 93-114<熱研7-20-59。從以上結果可以看出，93-114和湛試327-13是較好的耐寒性橡膠樹品種，適合于寒害較為嚴重的地區種植，熱研7-33-97是膠乳含量較高、耐寒性中等的橡膠樹品種，適合于寒害不太嚴重地區種植[38]。橡膠樹不同品種因低溫所致的爆皮流膠的耐受性機制及爆皮流膠耐受性與耐寒性的關系有待進一步探索。