不同獼猴桃品種果肉色素含量及關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律

涂美艷，陳 棟，廖明安，李 靖，孫淑霞，宋海巖，徐子鴻，劉春陽，江國(guó)良

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；3.達(dá)州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局果茶站，四川 達(dá)州 635000)

【研究意義】獼猴桃果肉顏色豐富，在不同種間及種內(nèi)均存在著廣泛變異[1]。目前世界上主栽獼猴桃品種從果肉顏色上大致可以分為3類，即綠肉品種(如‘Hayward’‘徐香’等)、黃肉品種(如‘金艷’‘Hort16A’等)及紅肉品種(如‘紅陽’‘東紅’等)。近年來，果肉顏色已成為獼猴桃選育種的重要性狀和研究熱點(diǎn)，但其呈色差異的機(jī)理依然不清楚。【前人研究進(jìn)展】已有研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃綠色果肉的主要成色色素是葉綠素，黃色果肉是類胡蘿卜素，紅色果肉是花色素苷[2]，而獼猴桃果肉顏色取決于色素類物質(zhì)葉綠素、花青素和類胡蘿卜素的含量、比例及空間分布，果肉中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的絕對(duì)含量和相對(duì)比例決定了果肉是呈現(xiàn)綠色還是黃色或者還是介于這兩種顏色之間[3]。中華獼猴桃果實(shí)成熟時(shí)果肉顏色很大程度上取決于果肉中殘留葉綠素的含量，由于果實(shí)成熟時(shí)間和成熟貯藏過程中葉綠素降解程度差異，果實(shí)在達(dá)到食用成熟度時(shí)，果肉顏色由綠色到黃色存在較大差異[4]。前人先后對(duì)大籽獼猴桃、葛棗獼猴桃、四萼獼猴桃、對(duì)萼獼猴桃[5]、‘Hort16A’[6]、‘武植3號(hào)’和‘金豐’[7]等野生種或品種的果實(shí)發(fā)育不同階段果肉色素代謝進(jìn)行了研究，普遍認(rèn)為隨著果實(shí)的生長(zhǎng)、成熟，果實(shí)葉綠素含量下降，其中葉綠素a的下降較快，而葉綠素b下降幅度較小[8]。不同品種獼猴桃果肉中類胡蘿卜素含量的變化較為復(fù)雜，可能下降也可能不變[9]，甚至在大籽獼猴桃果實(shí)發(fā)育過程中類胡蘿卜素含量還會(huì)上升[5]。獼猴桃果肉中花色苷代謝更為復(fù)雜，常出現(xiàn)果肉中色素不穩(wěn)定增減現(xiàn)象[10]，甚至同一品種在不同地區(qū)出現(xiàn)明顯呈色差異[11-12]。【本研究切入點(diǎn)】獼猴桃果肉顏色變化規(guī)律因品種和地域可能存在較大差異，而植物體內(nèi)除了色素物質(zhì)外，還有較多發(fā)色基團(tuán)，它們的代謝變化也會(huì)使植物器官在不同的發(fā)育時(shí)期和生理?xiàng)l件下呈現(xiàn)不同的色澤[13]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以四川主栽的不同果肉顏色品種為試材，通過分析果實(shí)發(fā)育過程中色素含量及色素代謝相關(guān)酶活性變化規(guī)律，探討紅肉、黃肉和綠肉獼猴桃果肉呈色的生理機(jī)制，為今后開展果肉顏色調(diào)控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以6個(gè)四川獼猴桃主栽品種為材料(表1)。其中，‘紅陽’‘紅實(shí)2號(hào)’‘金艷’‘金實(shí)1號(hào)’定植于四川省什邡市湔氐鎮(zhèn)下院村四川省自然資源科學(xué)研究院試驗(yàn)基地(海拔637 m， 31°13′35″ N，104°01′12″ E)，‘海沃德’和‘翠玉’定植于四川省彭州市小魚洞鎮(zhèn)草壩村龍門山獼猴桃基因庫(kù)試驗(yàn)基地(海拔1017 m，31°09′38″ N，103°47′14″ E)。

表1 試驗(yàn)材料基本情況

1.2 取樣時(shí)期及測(cè)試方法

每個(gè)品種從花蕾期開始，每2～3 d從代表性植株各方位選取果形端正、大小一致、無病蟲害花蕾或果實(shí)2個(gè)，帶回實(shí)驗(yàn)室切橫剖面觀察果肉顏色變化規(guī)律，并拍照比對(duì)，直至各品種果實(shí)成熟。根據(jù)果肉顏色變化規(guī)律觀察結(jié)果，選擇6個(gè)品種果實(shí)發(fā)育的6個(gè)代表性時(shí)期進(jìn)行采樣，具體采樣時(shí)期見表2。采樣前，每個(gè)品種選擇代表性植株3株掛牌標(biāo)記，每次采樣時(shí)從掛牌植株樹冠各方位隨機(jī)采集形狀、大小均勻一致且無病蟲害的果實(shí)(其中：S1時(shí)期50個(gè)/株，S2時(shí)期20個(gè)/株，S3、S4、S5、S6時(shí)期各5個(gè)/株)。采集樣品后用冰盒保存迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，單株為1組，3株即為實(shí)驗(yàn)的 3 次重復(fù)。每組果去掉外果皮后，從中間橫剖，再?gòu)臋M剖面上削薄片(去除干凈所有種子)剪碎混勻并立即用液氮處理，貯存于-80 ℃超低溫條件下備用。葉綠素及類胡蘿卜素含量的測(cè)定參照王學(xué)奎[14]的方法；花青素含量測(cè)定參照熊慶娥[15]的方法。

表2 第一部分試驗(yàn)采樣時(shí)期

為研究不同果肉部位色素含量與色素代謝關(guān)鍵酶活性關(guān)系，選擇‘紅實(shí)2號(hào)’和‘金實(shí)1號(hào)’2個(gè)代表性品種4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的2個(gè)果肉部位進(jìn)行采樣，具體采樣時(shí)期見表3。樣品采集前，選取6株長(zhǎng)勢(shì)一致、無病蟲害、果型大小一致的‘紅實(shí)2號(hào)’和‘金實(shí)1號(hào)’植株進(jìn)行掛牌。取樣時(shí)，T1時(shí)期每株隨機(jī)取代表性果實(shí)50個(gè)，T2、T3時(shí)期20個(gè)，T4時(shí)期2個(gè)，摘取果實(shí)后，迅速在冰塊上按內(nèi)果皮和中果皮切取樣品，其中，T2、T3、T4時(shí)期在獲取內(nèi)果皮樣品時(shí)，需快速剔除種子。所獲樣品分部位按單株混勻后，經(jīng)液氮凍存并轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ~綠素酶和脫鎂螯合酶提取液參照 Minguez-Mosquera等[16]方法；葉綠素酶活性測(cè)定參照 Fang等[17]的方法；略有修改；脫鎂螯合酶活性測(cè)定參照李繼蘭等[18]的方法，略有修改；苯丙氨酸解氨酶液提取及測(cè)試參照歐陽光察和曹錦萍等[19-20]的方法；二氫黃酮醇還原酶液提取參照Murray[21]的方法，測(cè)試參照Stafford等[22-23]的方法。

表3 第二部分試驗(yàn)采樣時(shí)期

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Excel 2003 軟件進(jìn)行初步分析并制作相應(yīng)的趨勢(shì)圖；用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃果實(shí)發(fā)育期果肉顏色變化規(guī)律

6個(gè)品種果肉顏色變化規(guī)律(圖1)如下。

圖1 6個(gè)獼猴桃品種果實(shí)發(fā)育期果肉顏色變化

‘紅陽’:花蕾期至盛花后15 d中果皮由紅色變?yōu)榈t色、內(nèi)果皮保持淡綠白色；盛花后15～55 d，中果皮和內(nèi)果皮均保持綠色；盛花后55 d至成熟期，中果皮由綠色變?yōu)榈S色、內(nèi)果皮由淡紅色變?yōu)榧t色。

‘紅實(shí)2號(hào)’:花蕾期至盛花后10 d中果皮由紅色變?yōu)榈t色、內(nèi)果皮保持淡綠白色；盛花后10～60 d，中果皮和內(nèi)果皮均保持綠色；盛花后60 d至成熟期，中果皮由綠色變?yōu)榈S色、內(nèi)果皮由淡紅色變?yōu)樯罴t色。

‘海沃德’：花蕾期至盛花后7 d中果皮和內(nèi)果皮均為淡綠白色，盛花后7 d至成熟期，中果皮和內(nèi)果皮保持綠色。

‘翠玉’：花蕾期至盛花后5 d中果皮由紅色變?yōu)榈t色、內(nèi)果皮保持淡綠白色；盛花后5 d至成熟期，中果皮和內(nèi)果皮由綠色變?yōu)榈G色(或黃綠色)。

‘金艷’：花蕾期至盛花后7 d中果皮和內(nèi)果皮均為淡綠白色，盛花后7～95 d，中果皮和內(nèi)果皮由淡綠色變?yōu)榈S色，盛花后95 d至成熟期，中果皮和內(nèi)果皮由淡黃色變?yōu)辄S色。

‘金實(shí)1號(hào)’：花蕾期至盛花后3 d中果皮由紅色變?yōu)榈t色、內(nèi)果皮保持淡綠白色；盛花后3～75 d，中果皮和內(nèi)果皮均保持綠色；盛花后75 d至成熟期，中果皮和內(nèi)果皮由淡黃色變?yōu)樯铧S色。

‘紅陽’和‘紅實(shí)2號(hào)’2個(gè)紅肉品種果肉顏色變化基本一致，‘海沃德’和‘金艷’2個(gè)品種果肉顏色變化與傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)也是一致的。但綠肉品種‘翠玉’和黃肉品種‘金實(shí)1號(hào)’首次發(fā)現(xiàn)在花蕾期至盛花后3～5 d也存在中果皮著紅色的現(xiàn)象，這與紅肉品種早期子房或幼果著色情況一樣，但該現(xiàn)象花后持續(xù)時(shí)間較紅肉品種短，且褪色后不再果肉任何部位啟動(dòng)著紅色。

2.2 獼猴桃果實(shí)發(fā)育期果肉色素含量變化規(guī)律

從圖2可以看出，不同品種在不同發(fā)育期果肉中葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量均存在一定差異，且該差異在盛花后35 d前表現(xiàn)非常明顯。具體來看：葉綠素a含量上(圖2-A)，盛花后5 d‘紅實(shí)2號(hào)’含量最高(42.49 mg/g)，‘金實(shí)1號(hào)’和‘紅陽’次之，分別為42.04、36.43 mg/g，綠肉品種‘海沃德’含量最低(12.38 mg/g)，盛花后20 d以‘紅陽’含量最高(39.38 mg/g)，其次為‘紅實(shí)2號(hào)’，2個(gè)綠肉品種和2個(gè)黃肉品種含量較低，僅為7.30～14.69 mg/g，盛花后65 d至采收前期，各品種果肉中葉綠素a含量均維持在較低水平，但在果實(shí)采收前期(S6)，以綠肉品種‘海沃德’含量最高(5.39 mg/g)，是其他品種的2.06～2.88倍。葉綠素b和葉綠素總量上的變化規(guī)律與葉綠素a基本一致(圖2-B，2-C)。但葉綠素a/b值上(圖2-D)，各品種均存在一定波動(dòng)性，以綠肉品種‘海沃德’波動(dòng)最大，呈現(xiàn)先升后降再升又降的趨勢(shì)，到果實(shí)采收前期(S6),以‘紅陽’的葉綠素a/b值最大(2.19)，其后依次為‘金實(shí)1號(hào)’‘紅實(shí)2號(hào)’‘海沃德’‘翠玉’，以‘金艷’最低(0.89)。

圖2 不同獼猴桃品種果實(shí)發(fā)育期葉綠素含量變化

從圖3可以看出，在果實(shí)發(fā)育早期(S1～S2)，‘紅陽’‘金實(shí)1號(hào)’‘紅實(shí)2號(hào)’3個(gè)品種果實(shí)中類胡蘿卜素含量顯著高于其他3個(gè)品種，以盛花后5 d‘金實(shí)1號(hào)’含量最高，達(dá)10.21 mg/g，分別是‘翠玉’‘海沃德’的2.50和1.85倍，但在S1～S3階段(盛花后5～35 d)，‘紅陽’和‘紅實(shí)2號(hào)’果實(shí)中類胡蘿卜素含量急速下降，‘金實(shí)1號(hào)’雖然也存在明顯下降，但S3期較S2期又有所上升。S4～S6期(盛花后65 d至采收前期)，雖然6個(gè)品種類胡蘿卜素含量均維持在較低水平，但品種間依然存在一定差異，均以‘翠玉’的含量最低，‘海沃德’次之，這2個(gè)綠肉品種在這段時(shí)期內(nèi)類胡蘿卜素含量均低于1 mg/g，從果實(shí)采收前期(S6)結(jié)果看，以‘紅實(shí)2號(hào)’類胡蘿卜素含量最高(1.72 mg/g)，‘紅陽’和‘金實(shí)1號(hào)’次之，‘翠玉’最低，僅為0.66 mg/g。由此看來，黃肉品種在類胡蘿卜素含量上的優(yōu)勢(shì)并不明顯。但通過對(duì)葉綠素與類胡蘿卜素含量比值分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，盛花后5 d時(shí)，‘海沃德’和‘翠玉’等綠肉品種葉綠素/類胡蘿卜素比值較其他品種稍低，但到果實(shí)采收前期(S6)，這2個(gè)品種葉綠素/類胡蘿卜素比值較其他品種都高，其中‘海沃德’為11.17，分別是‘紅陽’‘紅實(shí)2號(hào)’‘金艷’‘金實(shí)1號(hào)’的6.06、4.74、4.31和2.53倍。

圖3 不同獼猴桃品種果實(shí)發(fā)育期類胡蘿卜素含量變化

圖4 不同獼猴桃品種果實(shí)發(fā)育期葉綠素與類胡蘿卜素含量比值變化

從圖5可以看出，在整個(gè)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期，‘海沃德’雖然有少量花青素檢出，但含量極低，僅為0.07～0.23 nmol/g；‘紅陽’和‘紅實(shí)2號(hào)’花青素含量變化規(guī)律基本一致，呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)，但在盛花后5～20 d時(shí)，‘紅陽’的花青素含量較‘紅實(shí)2號(hào)’高，從盛花后65 d開始，‘紅實(shí)2號(hào)’的花青素含量明顯高于‘紅陽’，到采收前期時(shí)，‘紅實(shí)2號(hào)’的花青素含量較‘紅陽’高出54.77 nmol/g；‘翠玉’‘金實(shí)1號(hào)’‘金艷’雖然為綠肉或黃肉品種，但在盛花后5 d時(shí)，果實(shí)中花青素含量分別為12.87、18.77、9.18 nmol/g，結(jié)合2.1.1果肉色澤變化規(guī)律觀察結(jié)果，這與果實(shí)發(fā)育早期‘翠玉’和‘金實(shí)1號(hào)’中果皮呈紅色的表型是吻合的，但‘金艷’在各時(shí)期果肉從未呈現(xiàn)任何紅色，其整個(gè)發(fā)育期均有花青素檢出，這可能與該品種所含花青素種類、與其他色素的比例、細(xì)胞液的內(nèi)含物等有關(guān)。

圖5 不同獼猴桃品種果實(shí)發(fā)育期花青素含量變化

2.3 獼猴桃果實(shí)發(fā)育期色素代謝關(guān)鍵酶活性變化規(guī)律

葉綠素酶(Chlase)是葉綠素降解途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，作用是脫去植醇基生成脫植基葉綠素a[24]。從圖6-A可以看出，T1時(shí)期，‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮和中果皮的葉綠素酶活性均顯著高于‘金實(shí)1號(hào)’，且以‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮的酶活性最高，達(dá)1.52 U/g；T2時(shí)期，2個(gè)品種和2個(gè)果肉部位間葉綠素酶活性的差距均明顯縮小，但此時(shí)期以‘紅實(shí)2號(hào)’中果皮的酶活性最高，為0.42 U/g，‘金實(shí)1號(hào)’中果皮酶活性最低，為0.07 U/g；T3和T4時(shí)期，‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮酶活性未明顯變化，中果皮的酶活性較前2個(gè)時(shí)期有所下降，最后維持在0.13 U/g，但‘金實(shí)1號(hào)’中果皮和內(nèi)果皮葉綠素酶活性有所上升，最后分別為0.35和0.38 U/g。

圖6 獼猴桃果實(shí)發(fā)育期不同果肉部位色素合成關(guān)鍵酶活性變化

脫鎂螯合酶(MDCase)的作用是使脫植基葉綠素a脫去Mg2+形成脫鎂葉綠酸a，是葉綠素降解途徑中第二個(gè)關(guān)鍵酶[25]。從圖6-B可以看出，脫鎂螯合酶在2個(gè)獼猴桃品種果實(shí)發(fā)育前期(T1、T2和T3時(shí)期)活性均較高，但不同品種不同果實(shí)部位含量在此3個(gè)時(shí)期依然存在較大差異，T4時(shí)期2個(gè)品種不同果實(shí)部位的脫鎂螯合酶活性差異不明顯，且均在個(gè)時(shí)期中含量最低。具體來看，T1時(shí)期，‘紅實(shí)2號(hào)’中果皮的酶活性顯著高于內(nèi)果皮(高出40.62 U/g)，但‘金實(shí)1號(hào)’內(nèi)果皮的酶活性比中果皮高24.15 U/g；T2時(shí)期，‘紅實(shí)2號(hào)’和‘金實(shí)1號(hào)’的內(nèi)果皮酶活性均顯著高于外果皮；T3時(shí)期，‘金實(shí)1號(hào)’中果皮和內(nèi)果皮酶活性差異不明顯，但‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮比中果皮酶活性高11.48 U/g。

苯丙氨酸裂解酶(PAL)是花青素生物合成途徑中第一階段的關(guān)鍵調(diào)控酶[26]。從圖6-C可以看出，T1時(shí)期2個(gè)品種中果皮和內(nèi)果皮的酶活性均顯著高于其他3個(gè)時(shí)期，但‘紅實(shí)1號(hào)’相同時(shí)期不同果實(shí)部位間的酶活性差異不明顯，‘金實(shí)1號(hào)’則不同，其4個(gè)時(shí)期中果皮的酶活性均高于內(nèi)果皮，且在T1、T2和T3時(shí)期，中果皮和內(nèi)果皮酶活性差異顯著。

二氫黃酮醇還原酶(DFR)則是花青素生物合成途徑中第三階段的關(guān)鍵調(diào)控酶，直接影響著花青素骨架的合成[26]。從圖6-D可以看出，2品種不同時(shí)期不同果實(shí)部位DFR活性差異較大。具體來看，‘紅實(shí)2號(hào)’4個(gè)時(shí)期內(nèi)果皮的酶活性均高于中果皮，以T4時(shí)期差異最明顯，內(nèi)果皮高出中果皮54.90 U/g，T1時(shí)期次之(高出36.15 U/g)，T2時(shí)期差距最小(僅相差3.17 U/g)；‘金實(shí)1號(hào)’則不同，其T1、T2、T4時(shí)期中果皮的酶活性顯著高于內(nèi)果皮，以T1時(shí)期最顯著(高出179.17 U/g)，T2時(shí)期次之(高出54.86 U/g)，T3時(shí)期雖然是內(nèi)果皮的酶比中果皮高4.78 U/g，但兩者間差異不顯著。

2.4 獼猴桃果實(shí)色素含量與關(guān)鍵酶活性相關(guān)性

從表4可以看出，4個(gè)酶中，脫鎂螯合酶活性與不同果肉部位色素含量相關(guān)性最小，該酶僅與‘金實(shí)1號(hào)’內(nèi)果皮葉綠素a含量和‘紅實(shí)2號(hào)’中果皮葉綠素b含量呈顯著正相關(guān)。葉綠素酶活性與‘紅實(shí)2號(hào)’果實(shí)色素含量的相關(guān)性比‘金實(shí)1號(hào)’更明顯，其與‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮類胡蘿卜素含量、中果皮葉綠素a和b含量均呈極顯著正相關(guān)。苯丙氨酸裂解酶活性與兩品種中果皮的色素含量相關(guān)性比內(nèi)果皮更明顯，這在‘紅實(shí)2號(hào)’上表現(xiàn)更為突出，苯丙氨酸裂解酶與‘紅實(shí)2號(hào)’中果皮花青素、類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b含量和內(nèi)果皮類胡蘿卜素含量均呈極顯著正相關(guān)，與‘金實(shí)1號(hào)’中果皮花青素和葉綠素含量呈極顯著正相關(guān)。二氫黃酮醇還原酶活性與‘金實(shí)1號(hào)’果實(shí)色素含量的相關(guān)性比‘紅實(shí)2號(hào)’更明顯，其與‘金實(shí)1號(hào)’內(nèi)果皮和中果皮花青素、類胡蘿卜素、葉綠素a含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與‘金實(shí)1號(hào)’內(nèi)果皮葉綠素b含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮花青素、類胡蘿卜素含量以及中果皮花青素、類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b含量均呈顯著正相關(guān)。

表4 ‘紅實(shí)2號(hào)’和‘金實(shí)1號(hào)’不同果肉部位色素代謝關(guān)鍵酶與色素含量相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 不同獼猴桃品種果肉顏色變化差異及其與色素含量的關(guān)系

我國(guó)獼猴桃種質(zhì)資源豐富，果肉顏色變異大，但獼猴桃果肉色素以葉綠素、類胡蘿卜素和花青素為主，3種色素含量及比例差異是果肉最終呈色的重要影響因素。賈展慧[27]研究認(rèn)為，葉綠素降解、果肉褪綠、葉綠素與類胡蘿卜素含量之比迅速上升，以及類胡蘿卜素顯色是導(dǎo)致紅陽獼猴桃果肉色澤由綠色轉(zhuǎn)為黃色的呈色機(jī)理。李繼蘭[28]研究也發(fā)現(xiàn)綠肉和黃肉獼猴桃采后果實(shí)變黃是因?yàn)槿~綠素降解的速度快于類胡蘿卜素，導(dǎo)致類胡蘿卜素顯露出黃色。陶俊[29]在柑橘上的研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的柑橘果實(shí)呈現(xiàn)紅、橙、黃顏色差異的原因不是由于其果皮積累的色素種類不同，而是由于其果皮積累紅、橙色類胡蘿卜素的能力及其組成比例不同引起。章秋平[30]研究發(fā)現(xiàn)，在果肉純色的白肉桃和黃肉桃中都存在著少量的花色苷，這表明果肉的顏色還受到果肉中其它物質(zhì)含量的影響。翁文昕等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在‘華秀’李果肉著色過程中，果實(shí)中的葉綠素降解，花青苷大量合成，類胡蘿卜素在果肉由橙色期向紅色期轉(zhuǎn)變的過程中明顯增加，黃色期果肉的葉綠素含量所占比例最高，花青苷含量所占比例較低；橙色期果實(shí)的葉綠素和花青苷含量所占比例均較高；紅色期果實(shí)的花青苷含量所占比例遠(yuǎn)高于葉綠素和類胡蘿卜素含量所占比例。

本研究結(jié)果顯示，紅肉、黃肉和綠肉3種果肉顏色獼猴桃品種在果實(shí)發(fā)育期顏色變化差異大，即使同是綠肉或黃肉品種，其果肉顏色的變化規(guī)律也截然不同。其中，‘紅陽’和‘紅實(shí)2號(hào)’2個(gè)紅肉品種果肉顏色變化規(guī)律與Montefiori等[2]研究的紅肉品種‘Hort22D’基本一致，均在花蕾期至花后短暫的一段時(shí)間內(nèi)果實(shí)中花青素含量高，且中果皮顯紅色，之后隨著花青素含量急劇下降，葉綠素/類胡蘿卜素比值上升，整個(gè)果肉呈綠色，盛花后65～95 d，隨著果實(shí)中花青素含量再次快速上升，內(nèi)果皮(而非前期的中果皮)再次呈現(xiàn)出紅色。在整個(gè)發(fā)育過程中，雖然幼果期‘紅陽’的花青素含量高，但后期‘紅實(shí)2號(hào)’花青素含量明顯高出‘紅陽’，這是造成果實(shí)成熟期‘紅實(shí)2號(hào)’呈深紅色的重要因素。綠肉品種‘海沃德’在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期葉綠素含量變化不大，但在果實(shí)成熟前期類胡蘿卜素下降明顯，致使葉綠素/類胡蘿卜素比值上升是其顯翠綠色的主要因素。‘翠玉’雖然同為綠肉品種，但其與‘海沃德’明顯不同的是，在花蕾期至幼果期，果實(shí)中檢測(cè)出含有較高量花青素存在，且中果皮也與紅肉品種一樣顯紅色，只是后期褪色后，花青素含量明顯下降，且像‘海沃德’一樣，葉綠素/類胡蘿卜素比值在上升，只是上升速度沒有‘海沃德’明顯，所以其成熟期果肉顯淡綠色或黃綠色。黃肉品種‘金實(shí)1號(hào)’與‘翠玉’類似，也在花蕾期至幼果期因存在較高花青素含量而在中果皮顯紅色，但盛花75 d后，果實(shí)中葉綠素降解比類胡蘿卜素快，造成葉綠素/類胡蘿卜素比值下降明顯，最后呈深黃色。‘金艷’同為黃肉品種，但與‘金實(shí)1號(hào)’不同的是，其在盛花后5 d果實(shí)中也檢測(cè)到較高花青素含量(是同時(shí)期‘金實(shí)1號(hào)’含量的50%左右)，但并未呈現(xiàn)任何紅色，可能與該時(shí)期‘金艷’葉綠素和類胡蘿卜素含量也高，3種色素綜合影響下，呈現(xiàn)出淡綠白色，也可能與花青素種類、濃度、共色作用、液胞中pH的影響有關(guān)。

3.2 獼猴桃果實(shí)色素含量與代謝過程中關(guān)鍵酶活性的相關(guān)性

植物果實(shí)色素代謝過程涉及的酶種類多，而獼猴桃果實(shí)呈色主要與葉綠素降解和花青素積累有關(guān)。因此，本研究主要探討了葉綠素降解途徑2種關(guān)鍵酶(葉綠素酶和脫鎂螯合酶)與花青素合成途徑2種關(guān)鍵酶(苯丙氨酸解氨酶和二氫黃酮醇還原酶)對(duì)獼猴桃果肉呈色的影響。結(jié)果顯示，在果實(shí)發(fā)育早期(盛花后5 d時(shí))，4種酶在黃肉品種‘金實(shí)1號(hào)’和紅肉品種‘紅實(shí)2號(hào)’中均有很高活性，隨著果實(shí)生長(zhǎng)，4種酶活性整體呈下降趨勢(shì)。但到果實(shí)轉(zhuǎn)色關(guān)鍵期(T3)，‘金實(shí)1號(hào)’果實(shí)中的葉綠素酶和脫鎂螯合酶活性均快速增加，而‘紅實(shí)2號(hào)’果實(shí)中2個(gè)酶活性依然下降或保持不變，這可能是‘金實(shí)1號(hào)’在該時(shí)期出現(xiàn)綠色變淡黃色的重要原因。不過相關(guān)性研究結(jié)果表明，葉綠素酶與兩品種果實(shí)中類胡蘿卜素含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與‘金實(shí)1號(hào)’內(nèi)果皮葉綠素b含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮和中果皮葉綠素a含量呈顯著或極顯著正相關(guān)。而脫鎂螯合酶僅與‘紅實(shí)2號(hào)’中果皮的葉綠素b含量和‘金實(shí)1號(hào)’內(nèi)果皮葉綠素a含量呈顯著正相關(guān)。該相關(guān)性分析結(jié)果說明，葉綠素酶和脫鎂螯合酶并不是2個(gè)品種所有發(fā)育時(shí)期顯色差異的關(guān)鍵因素，但肯定在轉(zhuǎn)色關(guān)鍵期(T3時(shí)期)起著重要作用。

Arakawa[32]研究表明，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是花色苷合成的關(guān)鍵酶；Lister等[33]指出：只有在果皮變紅時(shí)PAL活性才與花色苷的合成密切相關(guān)；王惠聰?shù)萚34]在荔枝上的試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，PAL活性與荔枝果皮中的花色苷合成無關(guān)。本研究結(jié)果顯示，PAL與‘紅實(shí)2號(hào)’和‘金實(shí)1號(hào)’中果皮的花青素含量、葉綠素a含量均呈極顯著正相關(guān)，并與‘紅實(shí)2號(hào)’內(nèi)果皮類胡蘿卜素含量、‘金實(shí)1號(hào)’中果皮葉綠素a含量呈極顯著正相關(guān)。說明PAL雖然為花青素合成途徑上的關(guān)鍵酶，但其與其他色素含量還有著密切關(guān)系，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

據(jù)Murray等[35]報(bào)道，常春藤在幼年期葉片中二氫黃酮醇還原酶(DFR)的活性較高，莖和葉柄中有花色苷的積累，而在成熟階段，雖然植物體內(nèi)積累較多的櫟精，但DFR卻沒有活性，也沒有花色苷的積累，并從這一角度指出，DFR活性的缺乏會(huì)限制花色苷的積累。王惠聰?shù)萚34]在荔枝中的研究認(rèn)為DFR與荔枝果皮中花色苷的合成無密切關(guān)系。王慶菊等[35]研究認(rèn)為，PAL、CHI、DFR、UFGT 4個(gè)花色苷合成關(guān)鍵酶在紫葉稠李葉片花色苷合成過程中發(fā)揮著不同影響。花色苷的合成過程由DFR啟動(dòng)，CHI對(duì)花色苷合成起促進(jìn)作用，可能導(dǎo)致PAL活性的提高，UFGT起到糖基轉(zhuǎn)移的作用，提高了花色苷穩(wěn)定性，是花色苷合成過程的延續(xù)，促進(jìn)了花色苷的大量積累。因此，紫葉稠李葉片中花色苷的合成是4種酶共同作用的結(jié)果，不同時(shí)期由不同的酶起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，DFR活性與‘紅實(shí)2號(hào)’和‘金實(shí)1號(hào)’兩個(gè)品種不同果肉部位的花青素和類胡蘿卜素含量均呈顯著正相關(guān)，且與‘金實(shí)1號(hào)’中果皮和內(nèi)果皮花青素含量呈極顯著正相關(guān)。由此可知，‘金實(shí)1號(hào)’在果實(shí)發(fā)育后期花青素含量極低可能與DFR活性下降明顯有關(guān)。

4 結(jié) 論

獼猴桃在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期間，果肉色素含量變化及3種色素之間比例是決定其呈色的關(guān)鍵。而獼猴桃果肉最終呈色差異與果實(shí)早期發(fā)育階段著色情況關(guān)系不大，主要取決于發(fā)育中后期不同果肉部位色素的含量及比例。果實(shí)發(fā)育后期葉綠素降解和花青素積累是紅肉品種著紅色的主要因素，而果實(shí)發(fā)育后期較高的葉綠素/類胡蘿卜素比值(≥6.0)是綠肉品種呈綠色的主因，紅肉和黃肉品種均含有較高類胡蘿卜素，但黃肉品種在果實(shí)采收前期更低的葉綠素/類胡蘿卜素比值(2.6～4.4)可能是果肉呈黃色或深黃色的主因。另外，獼猴桃果肉呈色差異并不是單一色素含量的多少造成，而與色素間比值和多個(gè)酶活性密切相關(guān)。其中，脫鎂螯合酶在紅肉和黃肉品種色素代謝中作用不明顯，葉綠素酶、苯丙氨酸裂解酶和二氫黃酮醇還原酶是不同果肉顏色獼猴桃品種色素代謝途徑中調(diào)控的關(guān)鍵酶。