乳腺癌組織中黑色素瘤缺乏因子2的表達及其臨床意義

方佳彥, 梁寶珍, 鄒夢琦, 楊宇峰

(廣東省東莞市松山湖中心醫院, 1. 腫瘤科, 2. 乳腺甲狀腺科, 3. 病理科, 廣東 東莞, 523326)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在中國，乳腺癌發病率居女性惡性腫瘤首位[1]。因此，尋找可用于乳腺癌臨床診療及預后評估的分子標志物至關重要。黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)是一種炎癥小體，在腫瘤的發生發展中起重要作用。研究[2-4]表明, AIM2在非小細胞肺癌、宮頸癌、皮膚鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中低或高表達，并且其表達水平與癌癥患者預后密切相關。目前，關于AIM2與乳腺癌患者生存預后關系的研究較少。本研究檢測乳腺癌組織中AIM2的表達，并分析AIM2表達與乳腺癌患者臨床病理特征及生存的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市松山湖中心醫院2001年1月—2010年12月收治的118例乳腺癌患者的臨床病理資料。納入標準: 患者均為女性; 在本院經組織病理首次確診為乳腺浸潤性癌，并接受乳腺切除手術者; 患者術前均未行新輔助治療、放療和化療。排除標準: 未清掃淋巴結者; 臨床病理相關資料不完善者。118例乳腺癌患者年齡為34～72歲，中位年齡為47歲。病理醫師根據2019版WHO乳腺腫瘤病理學分類標準[5]明確乳腺癌病理分類、分級和分期，其中組織學分級Ⅰ級17例, Ⅱ～Ⅲ級101例; 非特殊型浸潤性癌114例，特殊型浸潤性癌4例; 有神經侵犯32例，無神經侵犯86例; 有脈管內癌栓34例，無脈管癌栓84例; 較高風險分子分型39例，較低風險分子分型79例; TNM分期Ⅰ～Ⅱ期92例, Ⅲ期26例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法: AIM2抗體購自Sigma公司，稀釋濃度1∶1 000。染色標本為原發乳腺癌組織及相應癌旁組織，癌旁組織距癌組織至少2 cm。嚴格按照說明書步驟進行操作，石蠟包埋組織標本4 μm厚連續切片，先后經常規脫蠟、阻斷內源性過氧化物酶、高壓抗原修復、一抗4 ℃過夜，去一抗后，滴加二抗, 37 ℃孵育30 min, 二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素襯染，顯微鏡下觀察染色強度及染色細胞所占比例。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，已知陽性標本為陽性對照。

1.2.2 結果判斷: AIM2定位于細胞漿，其表達水平通過染色強度及染色面積共同判定。① 染色面積<1%為0分, 1%～25%為1分; >25%～50%為2分; >50%～75%為3分; >75%～100%為4分; ② 染色強度無著色為0分，淡黃色為1分，中等黃色為2分，棕褐色為3分。以2項評分相乘所得表示蛋白表達水平，以中位評分數為蛋白表達水平的閾值。

1.2.3 隨訪: 通過門診隨訪或電話隨訪記錄患者腫瘤復發時間、死亡時間及死亡原因等信息。無瘤生存期為腫瘤手術切除至腫瘤復發間期，總生存期為腫瘤手術切除至患者死亡間期。

1.3 統計學分析

采用軟件SPSS 17.0進行統計學分析。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，計量資料比較采用t檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，采用COX回歸分析進行多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AIM2蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達

乳腺癌組織中AIM2蛋白陽性率為25.4%(30/118), 低于癌旁組織的89.0%(105/118), 差異有統計學意義(χ2=97.360,P=0.001)。 乳腺癌組織中AIM2免疫組化評分為(2.8±1.7)分，低于癌旁組織的(4.5±2.4)分，差異有統計學意義(t=3.375,P=0.001)。見圖1。

A: 乳腺癌組織中AIM2的表達; B: 癌旁組織中AIM2的表達; C: AIM2在乳腺癌組織和癌旁組織中免疫組化評分比較。放大倍數為200倍,免疫組化具體方法為SP法。圖1 免疫組化方法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中AIM2的表達

2.2 AIM2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

根據AIM2在乳腺癌組織中的表達水平(免疫組化評分中位數值3分)將所有患者分為AIM2低表達及高表達。乳腺癌組織中AIM2的表達水平與腫瘤直徑、淋巴結轉移狀態、腫瘤臨床分期和脈管內癌栓有關，差異有統計學意義(P<0.05); AIM2低表達與AIM2高表達患者在年齡、組織學分級、組織學類型、神經侵犯和分子分型方面比較，差異無統計學意義(P>0.05), 見表1。

表1 AIM2表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

2.3 AIM2蛋白與乳腺癌患者生存期的關系

AIM2低表達和AIM2高表達乳腺癌患者中位無瘤生存期分別為63個月和88個月，中位總生存期分別為94個月和103個月。Kaplan-Meier生存分析結果顯示, AIM2低表達乳腺癌患者無瘤生存期及總生存期均短于AIM2高表達患者，差異有統計學意義(χ2=9.072、6.101,P=0.004、0.015), 見圖2。

A: AIM2表達高低與無瘤生存期的關系; B: AIM2表達高低與總生存期的關系。

2.4 乳腺癌患者預后的COX回歸分析

單因素COX回歸分析顯示，腫瘤直徑、淋巴結轉移、腫瘤分期、AIM2蛋白和脈管內癌栓是乳腺癌患者無瘤生存期的影響因素，進一步多因素COX回歸分析顯示淋巴結轉移、腫瘤分期和AIM2蛋白是乳腺癌患者無瘤生存期的獨立影響因素，見表2; 單因素COX回歸分析顯示，淋巴結轉移、腫瘤分期和AIM2蛋白是乳腺癌患者總生存期的影響因素，進一步多因素COX回歸分析顯示，淋巴結轉移和腫瘤分期是乳腺癌患者總生存期的獨立影響因素，見表3。

表2 乳腺癌患者無瘤生存期影響因素的COX回歸分析

表3 乳腺癌患者總生存期影響因素的COX回歸分析

3 討 論

近年來乳腺癌發病率不斷升高，且有逐漸年輕化趨勢。目前，臨床通過檢測雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體2及Ki67等分子標志物的狀態粗略區分乳腺癌分子亞型，進而作為臨床開展精準治療和預后評估的依據。然而，由于乳腺癌的異質性，以上述分子標記物為基礎的乳腺癌分子分型有待完善，尋找新的潛在分子標志物有利于乳腺癌個體化治療及精準預后評估的進一步提升。

AIM2屬HIN-200蛋白家族成員，擁有HIN-200蛋白家族的典型結構域: C-末端的OB結構域和N-末端的熱蛋白結構域。AIM2屬于固有免疫系統，能識別并結合病毒或細菌感染時釋放到細胞質的雙鏈DNA, 進而活化半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1, 引起白細胞介素1β和白細胞介素18的成熟和分泌，或誘導細胞死亡[6]。研究[7-8]表明, AIM2不僅可參與固有免疫應答，還參與腫瘤的發生發展。已有研究表明, AIM2在多種惡性腫瘤中的表達會發生改變。AIM2在EB病毒相關的鼻咽癌[3]、口鱗狀細胞癌[9]、非小細胞肺癌[10]以及人乳頭狀瘤病毒(HPV)病毒相關的宮頸癌[11]中表達升高，而在肝細胞肝癌[12]、腸癌[13]、胃癌[14]、膽管癌[15]和胰腺癌[16]中表達降低或缺失。AIM2在不同類型癌組織中的表達差異提示，其在不同類型癌發生發展過程中可能具有獨特的作用，并不是在所有腫瘤中都表現出一致的抑制腫瘤或促進腫瘤進展的作用。本研究發現，AIM2在乳腺癌組織中低表達，表明乳腺癌中AIM2蛋白表達下調。雖然本研究未進一步從分子層面揭示AIM2在乳腺癌中低表達的機制，但已有研究[17]發現，細胞外游離DNA可誘導乳腺癌MCF7細胞株果蠅樣受體9(TLR9)表達，下調AIM2表達，敲降TLR9表達后可上調AIM2表達。此外，乳腺癌組織中AIM2蛋白表達與腫瘤直徑、淋巴結轉移狀態、脈管內癌栓和腫瘤分期相關，提示AIM2參與乳腺癌的發生發展。研究[18]發現, AIM2通過FcγR信號被募集到吞噬體中，并通過感知被吞噬的腫瘤DNA而被激活，隨后上調程序性死亡分子配體1和吲哚胺2, 3-雙加氧酶從而導致免疫抑制。LI Y Q等[19]通過體內、體外實驗發現，AIM2能抑制乳腺癌細胞增殖，并誘導其凋亡，因此AIM2在乳腺癌中發揮抑癌效應，進一步研究發現其抑癌功能的發揮與抑制NF-κB的轉錄活性有關。LIU Z Y 等[20]研究發現，誘導AIM2 過表達后引起細胞色素C 由線粒體釋放到胞漿，進而促進腫瘤細胞凋亡，并且其過表達后凋亡前體蛋白Bax表達增加，同時抗調亡蛋白Bcl-xl表達下調，引發DNA修復蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的裂解，從而誘發乳腺癌細胞調亡。這些研究說明AIM2在乳腺癌發生發展中起重要作用，深入研究其參與乳腺癌發生發展的具體分子機制不僅有助于揭示其生物學功能，還有助于理解其潛在臨床應用價值。

Kaplan-Meier生存分析顯示，與AIM2蛋白高表達患者相比, AIM2蛋白低表達的患者有較短的總生存期和無瘤生存期; 進一步COX回歸分析發現, AIM2蛋白是乳腺癌患者無瘤生存期的獨立影響因素。這些結果表明AIM2可作為預測乳腺癌患者手術后生存的潛在標志物。已有研究探討了AIM2表達與惡性腫瘤患者預后的關系。研究[21]顯示, AIM2組織表達水平是結直腸癌患者預后的獨立影響因素。在肝細胞肝癌中，分層生存分析結果表明, AIM2低表達患者比AIM2高表達患者有更短的總生存期和無瘤生存期[22]。在膽管癌[15]和胰腺癌[16]中, AIM2低表達可作為預測患者預后不良的獨立風險因素。然而，AIM2在EB病毒相關的鼻咽癌中高表達，并且其高表達與鼻咽癌患者較高的生存率相關，多因素分析進一步證實了AIM2在預測宮頸癌患者預后中的價值[3]。在非小細胞肺癌中, AIM2的高表達與患者預后不佳密切相關[10]。這些數據不僅表明AIM2有望成為預測多種惡性腫瘤患者預后的潛在標志物，也進一步提示其在不同類型癌發生發展中的獨特作用。本研究推測AIM2在乳腺癌中低表達可能通過促進乳腺癌細胞增殖并抑制其凋亡，從而促進乳腺癌生長，最終導致AIM2低表達乳腺癌患者預后不良[19-20]。

綜上所述, AIM2在乳腺癌組織中低表達，提示乳腺癌患者預后不佳。但本研究樣本數量較少，因此有必要收集更多來自不同醫院的病例，以進一步評估AIM2在預測乳腺癌患者預后中的價值。