長鏈非編碼RNA MIR22HG通過微小RNA-9-3p調節CTLA4抑制前列腺癌

張 偉, 施春梅, 朱 華, 顧棟華, 潘曉東, 陳新鳳, 鄭 兵

(南通大學第二附屬醫院/江蘇省南通市第一人民醫院 泌尿外科, 江蘇 南通, 226000)

前列腺癌是男性發病率較高的惡性腫瘤之一，目前臨床降低其病死率最有效的方法是早期診斷，并在前列腺癌發生擴散之前即進行介入治療[1-2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)可以通過表觀遺傳、轉錄和轉錄后機制參與腫瘤發生、生長和轉移等多種生物學過程。其中, LncRNA MIR22HG(簡稱MIR22HG)位于染色體17p13.3, 該染色體區域在肝癌等惡性腫瘤中表現為缺失、高甲基化或表現為雜合性缺失[3], 提示MIR22HG的異常表達可能參與了惡性腫瘤的發生發展。研究[4]顯示, MIR22HG通過調節微小RNA-9-3p (miR-9-3p)影響骨關節炎進展，此外MIR22HG 作為競爭性內源性 RNA發揮作用，與蛋白質、miRNA相互作用參與腫瘤的發生和進展。MIR22HG可提高免疫治療、靶向治療對癌癥的療效[5]。細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA4)是目前癌癥免疫治療研究領域較為熱門的基因。本研究擬分析MIR22HG/miR-9-3p是否能通過調節CTLA-4影響前列腺癌，以期為前列腺癌的免疫治療提供參考，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織、細胞及動物: 收集本院26例前列腺癌組織樣本和26例前列腺增生組織樣本。本研究經院倫理委員會批準，所有受試者或家屬了解本研究的內容和目的，并簽署知情同意書。人胚腎細胞HEK293和人前列腺癌細胞VCAP、PC3、LNCap、DU145均購自中國科學院上海生命科學研究所細胞庫。BALB/c裸鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要細胞、分子和化學試劑: MEM培養基和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司; 胎牛血清購自四季青; RNA提取試劑盒購自美國Omega公司; 脂質體Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司; Opti-MEM培養基購自美國Gibco公司; 海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司; 無RNase水和逆轉錄相關試劑購自美國Thermo Fisher公司; SYBR Green熒光定量試劑盒購自美國Bio-rad公司; Western blot相關試劑購自碧云天; CTLA4兔抗購自美國Abcam公司公司(ab237712); 羊抗兔二抗購自美國Abclonal公司(AS014); ECL顯色液購自美國Millipore公司; 異丙醇等化學試劑購自國藥集團; 戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染: ① 細胞培養。VCAP細胞以含10%胎牛血清的MEM培養基進行培養, PC3細胞、LNCap細胞和DU145細胞均以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基進行培養。所有細胞均置于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中培養。② 細胞篩選及轉染。將處于生長指數期的VCAP、PC3、LNCap和DU145細胞以5×104個細胞/孔接種到12孔板中，采用“1.2.2”項下的方法篩選出MIR22HG及miR-9-3p mRNA表達較高的細胞以進行下一步研究。按照5×104個細胞/孔將上述篩選出的細胞接種到12孔板中，待細胞完全貼壁后，按照每孔1 mL Opti-MEM培養基、1 μg質粒和2 μL Lipofectamine 3000的比例進行細胞轉染，分別轉染miR-9-3p及CTLA4, 轉染4 h后，吸去12孔板中的轉染試劑，并加入新的細胞培養使用的培養基。將細胞分為OE-CTLA4(CTLA4過表達組)、OE-MIR22HG(MIR22HG過表達組)、miR-9-3p mimic (miR-9-3p過表達組)、OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic (MIR22HG及miR-9-3p聯合過表達組)、OE-NC+NC mimic(轉染對照組)、NC mimic (miR-9-3p過表達對照組)。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR): 組織及細胞總RNA提取步驟參考Omega試劑盒的產品說明書。抽提所得的RNA使用Thermo Fisher的Nanodrop 2000儀器進行質檢，并檢測RNA濃度。根據濃度計算逆轉錄時使用RNA的體積。使用Thermo Fisher的逆轉錄試劑盒，將1 μg的RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應體系和逆轉錄反應程序參考Thermo Fisher的產品說明。使用無Rnase水稀釋cDNA 10倍，進行qRT-PCR, qRT-PCR擴增條件為50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個循環。MIR22HG引物為: 上游5′-AAGTTGGAGAGCCTTTGCCC-3′; 下游5′-CGCACTATGGTGCCACATCT-3′。miR-9-3p引物：上游5′-GCGGCGGATAAAGCTAGATAAC-3′, 下游5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。CTLA4引物：上游5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′, 下游5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′。內參分別為GAPDH(引物：上游5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′, 下游5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′)和U6(引物：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, 下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)。計算并比較前列腺癌組織和正常前列腺增生組織的VCAP細胞、PC3細胞、LNCap細胞與DU145細胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA相對表達，所有樣本均重復3次，取均值。選擇3種前列腺癌細胞中MIR22HG及miR-9-3p mRNA表達相對較高者進行下一步研究。

1.2.3 熒光素酶報告基因實驗: 將PC3細胞接種于24孔板內，培養24 h。人工構建miR-9-3p野生型啟動子雙熒光素酶報告基因載體pGL4.10-hRluc，將miR-9-3p預測結合位點突變的突變體Mut-miR-9-3p和MIR22HG雙熒光素酶報告基因載體共同轉染PC3細胞。轉染48 h后，吸出培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，收集并裂解細胞，將生長培養基吸盡, PBS漂洗，加入1×PLB裂解液室溫搖床充分裂解，以熒光素酶底物發光檢測儀測定熒光信號，重復3次。

1.2.4 蛋白質印跡法(Western blot): 以RIPA裂解液4 ℃孵育30 min裂解細胞，將裂解的細胞移至1.5 mL的EP管, 12 000 g 4 ℃離心15 min, 收集上清液。向上清液加入蛋白上樣緩沖液(loading buffer), 加熱煮沸5 min, 取20 mg的蛋白樣品，以10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 電泳參數0.3 A、20 V, 轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉封閉60 min, 加入CTLA4兔抗[洗膜緩沖液(TBST)稀釋，工作濃度1∶3 000], 4 ℃孵育過夜, TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗, 25 ℃孵育60 min, TBST洗膜6次, ECL顯色，重復3次。

1.2.5 前列腺癌異種移植模型的建立: 取裸鼠96只，將經不同處理的PC3細胞制成50 μL含有1×106個/mL細胞的懸液，即過表達MIR22HG和miR-9-3p, 合并50 μL Matrigel溶液注射在裸鼠的右腹股溝部，構建前列腺癌細胞的異種移植小鼠模型。將構建的小鼠模型分為OE-NC+NC mimic組(對照組)、OE-MIR22HG組(MIR22HG過表達組)及OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic組(MIR22HG及miR-9-3p過表達組)，每組32只。以接種細胞當日記為第0天, 自接種第7天開始，每周對8只小鼠進行手術移除原位移植瘤，并統計瘤體的體質量和體積變化，共檢測4周。腫瘤體積的計算公式為:V=0.8×2/3×D1×D2 (D1、D2分別為相互垂直的最長直徑與短直徑)。小鼠采用靜脈注釋3倍濃度的3%戊巴比妥鈉實行安樂死。本實驗已得到本院動物倫理會的批準。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 前列腺癌組織及細胞MIR22HG和

miR-9-3p mRNA相對表達

與前列腺增生組織相比，前列腺癌組織中MIR22HG mRNA降低, miR-9-3p mRNA增高，差異有統計學意義(P<0.05)。前列腺癌細胞VCAP、PC3、LNCap和DU145細胞中, PC3細胞MIR22HG mRNA相對較低, miR-9-3p mRNA相對較高(P<0.05), 因此選擇PC3細胞進行下一步研究。見圖1。

A: qRT-PCR檢測前列腺癌組織中MIR22HG的表達(與前列腺增生組織比較, *P<0.05); B: qRT-PCR檢測前列腺癌組織中miR-9-3p的表達(與前列腺增生組織比較, *P<0.05); C: qRT-PCR檢測前列腺癌細胞中MIR22HG和miR-9-3p的表達(與VCAP相比, *P<0.05); D: qRT-PCR檢測前列腺癌組織、前列腺癌細胞中MIR22HG和miR-9-3p的表達(1: 前列腺癌組織; 2: 正常前列腺增生組織; 3: VCAP; 4: PC3; 5: LNCap; 6: DU145)。圖1 前列腺癌組織及細胞的MIR22HG和miR-9-3p mRNA相對表達

2.2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表達

通過TargetScan網站(http://www.TargetScan.org)預測MIR22HG和miR-9-3p的靶向關系。在PC3細胞中成功過表達MIR22HG, 通過熒光素酶報告基因實驗驗證了MIR22HG和miR-9-3p的靶向抑制關系。過表達MIR22HG, miR-9-3p表達顯著下調(P<0.05), 結果表明MIR22HG可以靶向結合miR-9-3p, 并抑制其表達。見圖2。

A: MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用位點; B: qRT-PCR檢測MIR22HG的過表達效率(與OE-NC比較, *P<0.05); C: 熒光素酶報告實驗檢測MIR22HG和miR-9-3p的靶向作用(與OE-NC比較, *P<0.05); D: qRT-PCR檢測過表達MIR22HG后, miR-9-3p的表達(與OE-NC比較, *P<0.05)。圖2 MIR22HG靶向抑制miR-9-3p的表達

2.3 MIR22HG通過抑制miR-9-3p調控免疫基因CTLA4

TargetScan數據庫(http://www.TargetScan.org/)預測免疫基因CTLA4與miR-9-3p的靶向關系。在PC3細胞中成功過表達CTLA4, 通過熒光素酶報告基因實驗驗證miR-9-3p與CTLA4的靶向抑制關系。過表達miR-9-3p,CTLA4表達顯著上調(P<0.05), 結果表明miR-9-3p可能靶向激活CLTA4的表達。見圖3。

A: miR-9-3p和CTLA4的靶向作用位點; B: qRT-PCR檢測過表達CTLA4后, CTLA4 mRNA表達(與OE-NC比較, *P<0.05); C: Western blot檢測過表達CTLA4后, CTLA4蛋白表達(與OE-NC比較, *P<0.05); D: qRT-PCR檢測過表達miR-9-3p后, CTLA4 mRNA表達(與NC mimic比較, *P<0.05); E: Western blot檢測過表達miR-9-3p后, CTLA4蛋白表達(與NC mimic比較, *P<0.05); F: 熒光素酶報告實驗檢測miR-9-3p和CTLA4的靶向作用(與NC mimic比較, *P<0.05); G: qRT-PCR檢測過表達MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表達情況(與OE-NC+NC mimic比較, *P<0.05); H: Western blot檢測過表達MIR22HG和miR-9-3p后, CTLA4的表達情況(與OE-NC+NC mimic比較, *P<0.05)。圖3 MIR22HG通過抑制miR-9-3p調控免疫基因CTLA4

2.4 MIR22HG負調控CTLA4抑制前列腺癌細胞

與OE-NC+NC mimic組比較, OE-MIR22HG組裸鼠皮下腫瘤的質量和體積均減小，差異有統計學意義(P<0.05)。OE-MIR22HG+miR-9-3p mimic組裸鼠皮下腫瘤的質量和體積與OE-NC+NC mimic組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

3 討 論

在過去10年中，各種實體瘤的免疫治療實驗數量大幅增加，癌癥免疫治療取得了突飛猛進的發展，越來越多的癌癥預后預測因子被鑒定并驗證[6-7]。手術后化療和/或放療仍然是許多實體瘤的主要治療方法，但免疫治療正在迅速與其他療法結合，可改善患者生存率。免疫治療在前列腺癌中的治療效果有較高提升空間[8]。研究[9]表明，炎癥在前列腺癌的生長和轉移不同階段起著重要作用。從前列腺炎癥發作開始，各種信號通路在耐藥性和免疫抑制的發展中發揮關鍵作用[10-11]。

A: 皮下腫瘤質量(與OE-NC+NC mimic組比較, *P<0.05; 與OE-MIR22HG組比較, #P<0.05);B: 皮下腫瘤體積(與OE-NC+NC mimic組比較, *P<0.05; 與OE-MIR22HG組比較, #P<0.05)。

本研究結果顯示，前列腺癌的MIR22HG呈低表達, miR-9-3p呈高表達。研究[12]顯示, MIR22HG在結直腸癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌和甲狀腺癌等惡性腫瘤組織呈低表達，其作為競爭性內源性RNA (ceRNA)參與信號通路，與蛋白質相互作用參與腫瘤進展, MIR22HG低表達的癌癥患者預后較差。miR-9-3p在甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤組織呈高表達，下調miR-9-3p可逆轉甲狀腺乳頭狀癌細胞的上皮間質轉化，從而降低甲狀腺乳頭狀癌的侵襲和遷移活性，提示miR-9-3p具有促癌作用[13]。本研究通過TargetScan網站及熒光素酶報告基因實驗，驗證了MIR22HG與miR-9-3p的靶向抑制關系，與相關研究[14]中MIR22HG通過靶向調節miR-9-3p表達影響喉癌進展的結果相一致。

TargetScan數據庫及熒光素酶報告基因實驗驗證miR-9-3p與CTLA4存在靶向抑制關系，過表達miR-9-3p的CTLA4的表達也顯著上調，表明miR-9-3p可以靶向激活CLTA4的表達。CLTA4是活化T細胞表面表達的膜蛋白，對T細胞增生起負性調節作用，在自身免疫性疾病的發病中具有重要作用。CLTA4已被廣泛應用于免疫治療惡性腫瘤，如伊匹單抗通過作用于CTLA-4達到免疫治療前列腺癌的目的。本研究進一步通過裸鼠研究證實了上述論點，即分別構建過表達MIR22HG及過表達MIR22HG和miR-9-3p的前列腺癌細胞的異種移植小鼠，動態檢測接種后1～4周瘤體的質量、體積變化，結果顯示, OE-MIR22HG組裸鼠皮下腫瘤的質量和體積均顯著減小, MIR22HG及miR-9-3p聯合過表達組裸鼠皮下腫瘤的質量和體積與OE-NC+NC mimic差異無統計學意義，提示MIR22HG的抑癌作用可被過度表達的miR-9-3p抑制。但本研究存在不足，盡管本研究TargetScan數據庫及熒光素酶報告基因實驗驗證miR-9-3p與CTLA4存在靶向抑制關系，但miR-9-3p與CTLA4的關系鮮有文獻報道支持，本研究也未進行CTLA4細胞轉染裸鼠的在體研究驗證，因此未來還需進一步確認。

綜上所述, MIR22HG與miR-9-3p存在靶向負調節關系, miR-9-3p與CTLA4存在靶向調節關系, MIR22HG/miR-9-3p可能通過抑制CTLA4達到免疫治療前列腺癌的目的。