巨噬細胞胞外誘捕網誘導成纖維樣滑膜細胞活化作用在類風濕關節炎發病中的機制

黃賽賽, 趙 成, 梁 軍, 盧先艷, 王世穎

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院, 1. 風濕免疫科, 2. 婦產科, 江蘇 南京, 210008)

類風濕關節炎(RA)是以慢性滑膜增生和進行性關節破壞為特征的全身性自身免疫病[1]。RA的發病機制尚未完全闡明，遺傳易感因素和環境因素之間的相互作用是疾病發生所必需的。目前比較明確與RA發生相關的環境因素包括吸煙和感染[2], 但感染如何導致疾病發生的機制尚不清楚。研究[3]發現，胞外誘捕網(ETs)形成似乎也是RA的可能發病機制。

RA滑膜中存在多種慢性炎癥細胞浸潤，巨噬細胞和成纖維樣滑膜細胞(FLSs)是RA滑膜中最豐富的細胞類型。活化的巨噬細胞通過與炎癥微環境的相互作用，在炎癥的發展中起重要作用。中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)在病原微生物所致的感染性疾病和免疫性疾病中的作用機制逐漸被闡明[4]。研究[5]發現，巨噬細胞同樣可形成巨噬細胞胞外誘捕網(METs), 由于RA滑膜中存在大量的巨噬細胞，而中性粒細胞較為少見，本研究推測METs形成及其與FLSs的相互作用在RA發病過程中可能發揮重要作用。本研究探討巨噬細胞大量形成METs參與RA發病的機制，為進一步闡明RA發病機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

THP-1細胞(武漢普諾賽, CL-0233)、人FLSs(ATCC細胞庫)、佛波酯(Sigma, PMA 16561-29-8)、脂多糖(LPS, SIGMA)、干擾素γ(IFN-γ, Solarbio, P00028)、F4/80大鼠抗人(Abcam, ab16911)、MPO兔抗人(Proteintech, 22225-1-AP)、NE小鼠抗人(Abcam, ab254178)、AF488-驢抗大鼠(Abcam, ab102260)、AF594-山羊抗兔(Abcam, ab150080)、AF647-山羊抗小鼠(Abcam, ab150115)、AF488-山羊抗兔(Abcam, ab150077)、Ni-IDA-Beadose Resin Kit試劑盒(百奧萊博, Ni-IDA-Beadose Resin Kit, GS4622)、C29(MCE, HY-100461)、IAXO-102(MCE, HY-125171)、Cell Counting Kit-8(Dojindo)、細胞遷移和侵襲試劑盒(Millipore)、抗NE(Abcam, ab254178)、抗MPO(Proteintech, 22225-1-AP)、抗GAPDH(Abcam, ab9485)、IL-6(EK-Bioscience, EK-H10352)、MMP-1(MultiSciences, 70-EK1M01-96)、MMP-3(Sino Biological, SEK10467)、MMP-13(Sigma-Aldrich, RAB0364)。

1.2 THP-1細胞培養及誘導巨噬細胞

THP-1細胞培養于含有10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素+1%鏈霉素的RPMI-1640培養基中，培養環境為37 ℃, 5%CO2, 每隔3～4 d進行傳代。傳代的THP-1單核細胞放入含有10% 熱滅活胎牛血清和10 U/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液，在37 ℃、5%CO2培養箱中靜置培養，維持細胞數1×108/培養瓶左右。將培養的THP-1細胞稀釋成1×106/mL, 接種于35 mm培養皿中，于含100 ng/mL佛波酯、0.3% 牛血清白蛋白(BSA)的無血清RPMI 1640培養液中培養72 h誘導分化。通過光鏡進行形態學觀察，并采用熒光顯微鏡對誘導的細胞進行熒光鑒定。

1.3 巨噬細胞誘捕網的誘導及鑒定

采用5 μg/mL LPS和10 μmol/L IFN-γ分別處理巨噬細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養12 h時后，去除培養液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次30 s, 然后每個孔加入Sytox(1∶10 000)進行染色，免疫熒光染色法檢測METs的產生，并對其進行半定量分析。

1.4 免疫熒光

巨噬細胞進行爬片培養，采用5 μg/mL LPS和10 μmol/L IFN-γ分別處理巨噬細胞，在37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養12 h, PBS清洗1次, 4%多聚甲醛固定, 0.25%Triton X-100透膜20 min, 3%牛血清白蛋白(BSA)清洗3次，每次10 min, 然后10%山羊血清封閉1 h, 加入一抗混合液, 4 ℃孵育過夜。3% BSA清洗3次，每次10 min, 滴加熒光二抗混合液，避光孵育2 h。DAPI染核10 min, 3%BSA清洗3次，每次10 min, 抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5 METs蛋白組分純化

采用5 μg/mL LPS處理巨噬細胞細胞，在37 ℃、5%CO2培養箱中靜置培養12 h。12 h后，去除培養液，然后使用PBS清洗3次，每次1 min。按照Ni-IDA-Beadose Resin Kit試劑盒操作步驟來進行蛋白組分純化，并用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。

1.6 FLSs的培養及干預處理

將人FLSs接種至培養皿中, 37 ℃、5%CO2培養箱中培養。培養到細胞貼壁達到80%以上，用濃度為0.25%胰蛋白酶消化2 min, 消化過程每隔30 s吹打1次; 用含10% FBS的DMEM制備細胞懸液(1×106/mL), 加至培養板，每孔100 mL, 置37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h。采用METs蛋白組分以及Toll樣受體(TLR)抑制劑進行干預, METs蛋白組分的濃度為5 μg/mL: TLR2抑制劑C29的工作濃度為5 μmol/mL; TLR4抑制劑IAXO-102的工作濃度為10 μmol/mL; PBS作為空白對照。以上抑制劑單用或者聯用對滑膜細胞進行干預處理12 h, 然后進行后續實驗。

將人FLSs細胞系分為對照組、METs組、C29組、IAXO-102和C29+IAXO-102聯合干預組，除對照組外，其余組均將純化的METs蛋白組分加入FLSs培養液中, C29組同時加入TLR2抑制劑C29, IAXO-102組加入TLR4抑制劑IAXO-102, 聯合干預組同時加入C29和IAXO-102。

1.7 細胞活力和遷移侵襲能力檢測

取FLSs滑膜細胞懸液100 μL加入Transwell小室，進行培養, 12 h后加入不同的刺激物進行干預，繼續再培養12 h。收集細胞，使用細胞計數試劑盒(CCK8)測定細胞活力; 細胞遷移和侵襲試劑盒檢測細胞遷移和侵襲能力。

1.8 Western blot檢測蛋白表達

制備細胞懸液，加入適量蛋白裂解液[RIPA 蛋白裂解液1 mL + 磷酸酶/蛋白酶抑制劑10 μL+苯甲磺酰氟(PMSF)10 μL], 置于冰上，于搖床上裂解30 min, 離心去蛋白上清，BCA法測蛋白濃度，加熱使蛋白變性。向聚丙烯酸凝膠每孔中加入20～30 μg的蛋白樣品，經過電泳、轉膜等步驟將蛋白轉至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上，封閉洗滌后，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液(TBST)清洗3次，每次10 min, 然后室溫下二抗孵育2 h, 最后TBST清洗3次，每次10 min。使用Syngene G: BOX 凝膠成像系統，曝光拍照。

1.9 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞因子

表達

分別收集對照組、METs組、C29組、IAXO-102和C29+IAXO-102聯合干預組的培養液上清，根據制造商的說明，用ELISA試劑盒測量白細胞介素6(IL-6)、基質金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶3(MMP-3)和基質金屬蛋白酶13(MMP-13)的水平。所有標準品和樣品均使用酶標儀(SpectraMax M5, Molecular Devices)在 450/505 nm波長下進行測量。

1.10 統計學分析

運用SPSS 17.0統計分析軟件對數據進行分析，所有數據以均數±標準差表示, 2組正態分布資料采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 實驗與結果

2.1 THP-1細胞系誘導成巨噬細胞

采用佛波酯誘導THP-1細胞成巨噬細胞，通過光鏡進行形態學觀察，并采用熒光顯微鏡對誘導的細胞進行熒光鑒定(圖1), 藍色的DAPI為細胞核，綠色的F4/80為巨噬細胞標記物。

A: THP-1單核細胞系被誘導成巨噬細胞的明場圖像; B: THP-1單核細胞系被誘導成巨噬細胞的熒光鑒定,藍色的DAPI為細胞核,綠色的F4/80為巨噬細胞標記物,標尺為100 μm。圖1 THP-1細胞系誘導成巨噬細胞

2.2 LPS誘導巨噬細胞產生METs

分別使用LPS和IFN-γ誘導巨噬細胞產生METs, Sytox標記外泄的DNA水平，Western blot和免疫熒光法檢測METs主要蛋白成分彈性蛋白酶(NE)和髓過氧化物酶(MPO), 結果提示LPS誘導METs能力顯著強于IFN-γ(P<0.05), 外泄DNA采用綠色的Sytox標記，藍色的DAPI為細胞核，綠色的為MPO, 紅色為NE, 見圖2。

A: LPS與IFN-γ誘導巨噬細胞產生METs蛋白組分NE與MPO的能力; B: LPS與IFN-γ誘導巨噬細胞產生METs蛋白組分外泄的DNA能力的代表性圖像,外泄DNA采用綠色的Sytox標記,標尺為100 μm; C: LPS與IFN-γ誘導巨噬細胞產生METs蛋白組分彈性蛋白酶(NE)與髓過氧化物酶(MPO)能力的熒光代表性圖像; 藍色的DAPI為細胞核,綠色的為MPO, 紅色為NE, 標尺為100 μm。與LPS誘導METs比較, *P<0.05, **P<0.01。圖2 LPS、IFN-γ誘導METs的形成能力

2.3 METs蛋白組分對FLSs活化的影響

用METs蛋白組分刺激FLSs 24 h, 檢測FLSs細胞活力，結果顯示與對照組相比, METs蛋白顯著增強FLSs的活力、FLSs的遷移和侵襲能力(P<0.05); 同時上清中細胞因子IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平顯著升高(P<0.05)。與METs組相比，采用TLR2抑制劑(C29)和TLR4抑制劑(IAXO-102)單用或聯用干預后FLSs的活力下降，細胞遷移和侵襲能力減弱(P<0.05), 聯合干預組上清中IL-6[對照組: (26.03±4.99) pg/mL; METs組: (337.80±67.34) pg/mL; C29組: (183.80±11.73) pg/mL; IAXO-102組: (78.85±8.02) pg/mL; C29+IAXO-102聯合干預組: (82.30±11.05) pg/mL]、MMP-1[對照組: (234.90±31.40) pg/mL; METs組: (3 404.00±678.70) pg/mL; C29組: (1 750.00±191.00) pg/mL; IAXO-102 組: (766.50±85.14) pg/mL; C29+IAXO-102聯合干預組: (790.50±134.60) pg/mL)]、MMP-3[對照組: (18.44±4.88) pg/mL; METs組: (151.60±21.49) pg/mL; C29組: (115.80±9.76) pg/mL; IAXO-102組: (94.27±16.86) pg/mL; C29+IAXO-102 聯合干預組: (97.04±11.50) pg/mL]和MMP-13[對照組: (118.40±20.87) pg/mL; METs組: (836.40±105.20) pg/mL; C29 組: (587.70±90.57) pg/mL; IAXO-102組: (396.20±80.91) pg/mL; C29+IAXO-102聯合干預組: (327.20±60.74) pg/mL]水平下降(P<0.05), 且IAXO-102組抑制能力強于C29組，差異有統計學意義(P<0.05), 見圖3。

A: CCK-8檢測各組FLSs細胞的活力; B: 不同處理條件下的FLSs遷移能力結晶紫染色代表性圖像,標尺為100 μm; C: 不同處理條件下的FLSs侵襲能力結晶紫染色代表性圖像,標尺為100 μm; D: ELISA檢測各組FLSs培養上清細胞產生IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13的水平; 與METs單用比較, C29和IAXO-102單用或聯用干預后FLSs的活力下降,細胞遷移和侵襲能力減弱,上清IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平增高; 與C29組比較, IAXO-102組抑制能力更強, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。 圖3 METs通過TLR2和TLR4促進FLSs活化

3 討 論

NETs 組成成分復雜，其網狀結構中附著多種參與炎癥反應的蛋白[6]。RA患者外周血和滑液中NETs的形成數量顯著高于健康人群，且NETs數量與炎癥指標如血沉、C反應蛋白以及RA標志性自身抗體抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)水平均存在顯著正相關性。本實驗室前期研究也證實由瓜氨酸化蛋白介導生成的NETs可以作用于滑膜FLSs, 促進FLSs分泌炎性細胞因子、趨化因子、黏附分子等，從而擴大RA的炎癥反應。研究[7]發現，巨噬細胞同樣可形成METs。METs與NETs具有相似的特征，由DNA纖維和組蛋白等細胞蛋白組成。目前研究[8]發現，細菌、病毒等病原微生物以及M1型巨噬細胞等均可導致METs形成增多。本實驗室前期研究發現, RA滑膜巨噬細胞較正常人明顯增多，增多的巨噬細胞產生大量METs，提示其可能參與RA發病，但具體機制尚不清楚。

滑膜是RA炎癥發生的主要場所，高度活化的滑膜巨噬細胞能夠通過與FLSs相互作用分泌介質，促進滑膜炎的持續和細胞外基質的破壞。滑膜巨噬細胞能產生致炎細胞因子[腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、IL-6等][9]、趨化因子[趨化因子2(CCL-2)、趨化因子3(CCL-3)、趨化因子5(CCL-5)、趨化因子8(CXCL-8)和趨化因子1(CXCL-1)][10]和生長因子，而活化的FLSs是RA患者IL-6和基質金屬蛋白酶(MMPs)的主要來源。本實驗室前期研究發現, RA滑膜存在METs過度形成的現象。METs的成分較為復雜，主要由DNA組成的胞外纖維和蛋白組分構成。將純化的METs蛋白組分加入FLSs培養液中，結果發現, METs中的蛋白組分可以增強FLSs的活力，促進FLSs分泌IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13, 并增強FLSs的遷移和侵襲能力，提示METs蛋白參與FLSs的激活，但其具體機制尚未明確。

TLRs是一類重要的模式識別受體，可識別微生物感染的存在，激發機體免疫反應。同時, TLRs識別一些宿主衍生分子降解產物，即損傷相關模式分子(DAMPS), 主要包括細胞壞死后釋放的細胞內分子和細胞外基質分子等[11]。TLR2和TLR4在類風濕關節炎患者成纖維細胞(FLSs)活化過程中發揮重要作用。細菌肽聚糖(PGs)通過TLR2促進FLSs中MMP-1、MMP-3、MMP-13、IL-6和IL-8的表達[12]。TLR4在氧化劑刺激下，誘導FLSs增殖，導致高遷移率蛋白酶1(HMGB1)和其他炎癥因子釋放[13]。此外, TLR2表達增加，可上調磷脂酶A2(PLA2)的磷酸化水平，促進花生四烯酸(AA)的釋放、前列腺素E2(PGE2)的產生和FLSs中促炎因子的表達，參與RA炎癥過程[14]。本實驗室前期研究發現，純化的METs蛋白可以激活FLSs, 在培養體系中單獨或同時加入TLR2、TLR4抑制物, FLSs活化能力顯著減弱，且TLR4抑制物(IAXO-102)作用顯著強于TLR2抑制物(C29), 提示METs蛋白作為損傷相關模式分子活化TLR4, 活化的TLR4進一步激活FLSs, 進而參與RA發病。

本研究探討了巨噬細胞除增殖、極化參與RA炎癥外，還可通過形成METs激活FLSs, 進而參與RA發病。本研究以期為進一步闡明RA發病機制提供理論依據。