啤酒糟中細菌的分離鑒定及其在啤酒糟發酵中的應用

商曰玲，范 瑩，余 嵐，余曉紅

（鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051）

啤酒糟是啤酒釀造過程中最主要的副產物，俗稱麥糟，是麥芽和大米、淀粉等輔料經過糊化、糖化、過濾糖化醪后，分離的不溶性殘渣物，其主要成分為非淀粉多糖（纖維素、半纖維素，30%～50%）和蛋白質（19%～30%）[1]，除此之外，還含有大量的酚類化合物、維生素和礦物質等[2-4]。對于啤酒糟，傳統處理方式是堆肥和用于動物飼料[5]，既可作為廉價氮源[6]，又能為動物提供所必需的含氮營養物質[7]，由于濕啤酒糟具有較高含水量益于消化，多用作反芻動物的蛋白飼料[8]，但其易酸敗變質而產生大量有機酸、雜醇油及毒素等[9]，并且含有較多的抗營養因子，直接飼喂將會影響到動物的消化吸收[10]，限制了啤酒糟直接作為飼料的可行性。與此同時，飼料市場需求也十分有限，故大多數啤酒糟常作為固體廢物直接排放[11]，產生巨大的資源浪費，并且啤酒糟營養豐富，若不經一定的處理就排放，易造成微生物富集而污染環境。

啤酒糟具有增值化潛力，經正確處理后可轉化為有價值的資源，從而大大降低生產成本，并促進其他產業經濟的發展。要實現啤酒糟資源化利用，高效且低成本的降解技術是必須解決的難題，啤酒糟的降解方法主要為微生物發酵法[12]、堿法[13]以及酶法[14]等，其中微生物降解技術操作簡單且不污染環境，效果好，成本低，同時還能有效降低啤酒糟粗纖維含量和提高蛋白質含量[15]，故微生物發酵法在降解啤酒糟方面具有非常廣闊的市場前景，為啤酒糟的降解利用提供了新思路。

現有研究對啤酒糟的降解主要利用真菌微生物，如黑曲霉（Aspergillus niger）[16]和出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）[17]，對細菌發酵降解啤酒糟的研究較少。因此，本研究采用傳統培養分離方法從啤酒糟中分離細菌微生物，通過形態觀察及分子生物學技術對其進行菌種鑒定，再利用其對啤酒糟進行發酵，并與常規真菌對比，探究啤酒糟中細菌對啤酒糟的降解能力，以期為啤酒糟的進一步降解研究提供思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

啤酒糟：鹽城工學院啤酒中試實驗室；出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）：鹽城工學院實驗室保藏。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基[18]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌15～20 min。PDA液體培養基中不添加瓊脂。

LB培養基[19]：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。

啤酒糟培養基[17]：將啤酒糟粉碎過60目篩，取20 g啤酒糟于錐形瓶中，加入50 mL去離子水，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 化學試劑

酵母膏、胰蛋白胨（均為生化試劑）：賽默飛世爾科技公司；瓊脂、牛白蛋白（均為生化試劑）、葡萄糖、四水酒石酸鉀鈉、考馬斯亮藍G-250、三水醋酸鈉、乙酸、木糖、木聚糖、十二烷基硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、磷酸、硫酸銨、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉、無水乙醇、四硼酸鈉（均為分析純）：江蘇彤晟化學試劑有限公司；硫酸卡那霉素、丙酮（均為分析純）：南京都萊生物技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外可見分光光度計：尤尼科儀器有限公司；HWS-26數顯恒溫水浴鍋、LRH-500F低溫培養箱、THZ-300C恒溫培養搖床：上海一恒科學儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；SW-CJ-1D超凈工作臺：江蘇通凈凈化設備有限公司；YXQ-50A立式全自動高壓滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 啤酒糟細菌微生物的分離純化

將啤酒糟粉碎，取10 g啤酒糟于已滅菌的錐形瓶中，加入90 mL的無菌水，28 ℃、150 r/min搖床培養30 min后，取適量發酵液進行梯度稀釋，接種于LB培養基，于37 ℃條件下進行培養，分離并純化單菌落，保存。

1.3.2 菌種鑒定

形態觀察：將分離純化得到的細菌接種于LB固體培養基，37 ℃培養12～14 h，觀察菌落形態特點，保存菌落形態具有顯著差異的單菌落。

分子生物學鑒定：采用相應的基因組提取試劑盒對細菌單菌落的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行提取，以其為模板，采用引物對27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）/1492R（5'-TACGACTTAACCCCAATCGC-3'）對細菌的16S rDNA基因序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR擴增體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上、下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL、雙蒸水（ddH2O）10 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55～58 ℃復性1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，委托通用生物（安徽）股份有限公司進行測序。將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對比，根據相似度對菌株進行鑒定。

1.3.3 啤酒糟發酵

在PDA斜面培養基上分別接種黑曲霉和出芽短梗霉，于恒溫培養箱中28 ℃培養7 d，待長滿斜面后，將菌種接入PDA液態培養基中，在28 ℃、180 r/min條件下搖床培養3 d，即為真菌種子液。從LB固體培養基上挑取分離得到的細菌分別接入LB液體培養基，在37 ℃、180 r/min條件下搖床培養8 h，即為細菌種子液。按12%（V/V）的接種量取種子液到啤酒糟培養基中，28 ℃、150 r/min搖床培養4 d。通過測定發酵液中蛋白質、膳食纖維、還原糖、阿魏酰低聚糖含量和木聚糖酶、羧甲基纖維素酶酶活，比較研究啤酒糟中分離獲得細菌微生物與常用啤酒糟降解真菌的發酵降解效果。

1.3.4 發酵啤酒糟理化指標的測定

蛋白質含量的測定：采用考馬斯亮藍染色法；不溶性膳食纖維含量的測定：參照金信江[20]的方法；可溶性膳食纖維含量的測定：參照鄔建國等[21]的方法；還原糖含量的測定：采用DNS法測定；阿魏酰低聚糖（feruloyl oligosaccharides，FOs）含量的測定：采用雙波長法測定；木聚糖酶活力的測定：參照沈誠等[22]的方法；羧甲基纖維素酶活力的測定：參照杜曉梅等[23]的方法。

1.3.5 數據處理

實驗結果及制圖采用Excel 2019和Origin 9.0軟件進行分析處理，并運用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和MEGA 11.0軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 啤酒糟中細菌微生物的分離及鑒定

2.1.1 細菌微生物的分離及形態觀察

通過LB培養基從啤酒糟中共分離出6株菌落形態特征完全不同的細菌，分別編號為B1～B6，其菌落形態見圖1。

圖1 分離細菌的菌落形態Fig.1 Colony morphologies of isolated bacteria

由圖1可知，6種細菌B1～B6的菌落均近似圓形，菌株B1呈啞光白色，菌株B2呈啞光黃色，菌株B3表面粗糙且存在中心圓狀凹陷，呈白色不透明狀，菌株B4～B6的菌落邊緣不規則，內部有褶皺，呈白色。

2.1.2 分子生物學鑒定

將測序結果在NCBI上進行BLAST比對分析，結果見表1。由表1可知，6種細菌B1～B6分別與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）（LC052668.1）、梭菌屬（Clostridiumsp.）（HQ183777.1）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）（KP967704.1）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）（CP051463.1）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）（MT176526.1）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（CP028213.1）相似度最高。

表1 NCBI序列比對結果Table 1 Results of NCBI sequence alignment

結合形態觀察，將細菌B1～B6分別鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、梭菌屬（Clostridiumsp.）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 不同微生物發酵對啤酒糟的影響

有研究表明[24]，微生物發酵時可產生蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶等分解酶類，應用微生物發酵可以同時水解原料中的蛋白質和淀粉，以及水解其中的半纖維素以制備阿魏酰低聚糖，因此，發酵后產生的阿魏酰低聚糖含量可以作為初步探究細菌微生物對啤酒糟降解能力的指標。前期試驗發現，細菌B1（蠟樣芽孢桿菌）、B2（梭菌屬）和B3（解淀粉芽孢桿菌）的阿魏酰低聚糖產量較高，因此將該3株細菌作為目標菌發酵啤酒糟。

2.2.1 發酵啤酒糟中蛋白質含量的分析

不同微生物發酵啤酒糟樣品中蛋白質的含量測定結果見圖2。

圖2 不同微生物發酵啤酒糟中蛋白質含量的測定結果Fig.2 Determination results of protein contents in brewer's spent grain fermented by different microorganisms

由圖2可知，不同微生物發酵啤酒糟的蛋白質含量大小依次為：菌株B3＞黑曲霉＞出芽短梗霉＞菌株B2＞菌株B1。其中，菌株B3發酵啤酒糟所得的蛋白質含量最高，為25.26%，菌株B1發酵啤酒糟所得的蛋白質含量最低，為10.08%。王曉力等[25]對3個地區的啤酒糟中蛋白質含量進行研究發現，蛋白質含量均＞20%，本研究利用解淀粉芽孢桿菌B3發酵啤酒糟中的蛋白質含量＞25%。有研究表明，啤酒糟具有特殊結構，其所含蛋白被周圍纖維素緊緊包埋住，從而使啤酒糟蛋白的提取率和純度較低[14]，綜合來看解淀粉芽孢桿菌B3對啤酒糟纖維素具有一定降解能力，從而釋放被包埋的蛋白質。此外，菌株在發酵過程中，產生相應的降解酶類，進而增加蛋白質含量。

2.2.2 發酵啤酒糟中不溶性膳食纖維含量的分析

啤酒糟中膳食纖維是可利用的主要營養成分之一，研究微生物發酵啤酒糟中膳食纖維含量，是反應啤酒糟降解利用的重要指標[26]。不同微生物發酵啤酒糟樣品中不溶性膳食纖維含量的測定結果見圖3。

圖3 不同微生物發酵啤酒糟中不溶性膳食纖維含量的測定結果Fig.3 Determination results of insoluble dietary fiber contents in brewer's spent grain fermented by different microorganisms

由圖3可知，不同微生物發酵啤酒糟所得的不溶性膳食纖維的含量大小依次為：菌株B1＞菌株B2＞出芽短梗霉＞黑曲霉＞菌株B3。其中，菌株B1發酵啤酒糟所得的不溶性膳食纖維含量最高，為68.81%，菌株B3發酵啤酒糟所得的不溶性膳食纖維含量最低，為51.39%。綜合來看，菌株B3發酵啤酒糟后所剩不溶性膳食纖維含量低，可以推測解淀粉芽孢桿菌B3的纖維素酶活可能相對較高，對啤酒糟中不溶性膳食纖維的降解能力較強。

2.2.3 發酵啤酒糟中可溶性膳食纖維含量的分析

不同微生物發酵啤酒糟樣品中可溶性膳食纖維含量的測定結果見圖4。

圖4 不同微生物發酵啤酒糟中可溶性膳食纖維含量的測定結果Fig.4 Determination results of soluble dietary fiber contents in brewer's spent grain fermented by different microorganisms

由圖4可知，不同微生物發酵啤酒糟所得的可溶性膳食纖維的含量大小依次為：菌株B2＞菌株B1＞菌株B3＞黑曲霉＞出芽短梗霉。其中，菌株B2發酵啤酒糟所得的可溶性膳食纖維含量最高，為9.45%，出芽短梗霉發酵啤酒糟所得的可溶性膳食纖維含量最低，為5.36%。有研究表明，以大麥為原料的啤酒糟中各類膳食纖維含量（干質量）為8%[27]，姜福佳等[28]利用酶法對啤酒糟中的水溶性膳食纖維進行提取，得率為5.09%。綜合來看，菌株B2對啤酒糟的降解能力較好，且細菌發酵的降解能力要優于真菌。

2.2.4 發酵啤酒糟中總還原糖含量的分析

在啤酒糟降解過程中會產生多種分解酶類，而啤酒糟中含有豐富的多糖，因此，在微生物發酵啤酒糟過程中所含多糖成分會被分解，產生還原糖等小分子物質。不同微生物發酵啤酒糟樣品中的總還原糖含量測定結果見圖5。

圖5 不同微生物發酵啤酒糟中總還原糖含量的測定結果Fig.5 Determination results of total reducing sugar contents in brewer's spent grain fermented by different microorganisms

由圖5可知，不同微生物發酵啤酒糟的總還原糖含量大小依次為：菌株B3＞出芽短梗霉＞黑曲霉＞菌株B2＞菌株B1。其中，菌株B3發酵啤酒糟的總還原糖含量最高，為3.92%，菌株B1發酵啤酒糟中的總還原糖最低，為2.32%。綜上，解淀粉芽孢桿菌B3發酵啤酒糟制備總還原糖的能力要明顯好于其他4種微生物（P＜0.05）。

2.2.5 發酵啤酒糟中阿魏酰低聚糖含量的分析

阿魏酰低聚糖是一種天然抗氧化劑，主要來源于谷物的皮殼或細胞壁[29]，不同微生物發酵啤酒糟中阿魏酰低聚糖的含量測定結果見圖6。

圖6 不同微生物發酵啤酒糟中阿魏酰低聚糖含量的測定結果Fig.6 Determination results of feruloyl oligosaccharides contents in brewer's spent grain fermented by different microorganisms

由圖6可知，不同微生物發酵啤酒糟中阿魏酰低聚糖的含量大小依次為：菌株B3＞出芽短梗霉＞黑曲霉＞菌株B2＞菌株B1。其中，菌株B3發酵啤酒糟中的阿魏酰低聚糖含量最高，為10.01 μmol/L，菌株B1發酵啤酒糟中的阿魏酰低聚糖最低，為4.33 μmol/L，說明解淀粉芽孢桿菌B3在降解啤酒糟產生高附加值利用的低聚糖方面，具有一定潛力。

2.2.6 發酵啤酒糟中木聚糖酶酶活的分析

木聚糖是啤酒糟中的主要無氮浸出物，是誘導生產木聚糖酶較佳的基質[30]，有研究利用微生物菌種發酵啤酒糟生產木聚糖酶，且所得木聚糖酶活性較高[31]。不同微生物發酵啤酒糟的木聚糖酶酶活測定結果見圖7。

圖7 不同微生物發酵啤酒糟木聚糖酶酶活的測定結果Fig.7 Determination results of xylanase activities of brewer's spent grain fermented by different microorganisms

由圖7可知，不同微生物發酵啤酒糟的木聚糖酶酶活大小依次為：菌株B3＞黑曲霉＞出芽短梗霉＞菌株B1＞菌株B2。其中，菌株B3發酵啤酒糟的木聚糖酶酶活最高，為803.59 U，菌株B2發酵啤酒糟的木聚糖酶活最低，為462.39 U。鮮啤酒糟中含有11.5%的無氮浸出物（主要為木聚糖），并且目前木聚糖酶的生產成本較高[32]，綜上可知，利用解淀粉芽孢桿菌B3發酵啤酒糟不僅起到較好的降解效果，而且進一步提高了啤酒糟的經濟效益。

2.2.7 發酵啤酒糟中羧甲基纖維素酶酶活的分析

羧甲基纖維素酶是一種內切葡聚糖酶，是降解纖維素過程中的主要酶[33]，不同微生物發酵啤酒糟的羧甲基纖維素酶酶活測定結果見圖8。

由圖8可知，不同微生物發酵啤酒糟所得的羧甲基纖維素酶酶活大小依次為：菌株B3＞黑曲霉＞出芽短梗霉＞菌株B2＞菌株B1。其中，菌株B3發酵啤酒糟的羧甲基纖維素酶酶活最高，為38.16 U，菌株B1發酵啤酒糟的羧甲基纖維素酶酶活最低，為10.74 U。賓冬梅等[34]利用黑曲霉、康氏木酶（Rrichoderma koningi）、曲霉（Aspergillus）和青霉（Penicillium）對啤酒糟進行發酵，結果發現，單菌使用黑曲霉進行發酵所得纖維素酶活力較好。本研究表明，解淀粉芽孢桿菌B3發酵啤酒糟的羧甲基纖維素酶酶活高于黑曲霉。綜上可知，解淀粉芽孢桿菌B3對啤酒糟的降解效果較好。

圖8 不同微生物發酵啤酒糟羧甲基纖維素酶酶活的測定結果Fig.8 Determination results of carboxymethyl cellulase activities of brewer's spent grain fermented by different microorganisms

3 結論

本研究通過傳統培養分離方法從啤酒糟中共分離得到6種細菌，編號為B1～B6經形態觀察及分子生物學技術，B1～B6分別為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、梭狀菌屬（Clostridiumsp.）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。以黑曲霉和出芽短梗霉為對照，利用蠟樣芽孢桿菌B1、梭狀芽孢桿菌B2、解淀粉芽孢桿菌B3分別發酵啤酒糟，結果發現，解淀粉芽孢桿菌B3對啤酒糟的降解效果優于真菌，為最優發酵菌株，其發酵啤酒糟的蛋白質、總還原糖、阿魏酰低聚糖、木聚糖酶酶活及羧甲基纖維素酶酶活均達到最高，分別為25.26%、3.92%、10.01 μmol/L、803.59 U、38.16 U。本研究篩選出具有較好降解能力的菌種B3，為啤酒糟的進一步發酵降解利用以及后續尋找性能更加優越的降解菌株提供了研究思路與理論依據。