不同醋酸菌及發酵方式對柑橘果醋品質的影響

劉天宇，丁健洋，許立偉，薛桂新

（延邊大學 農學院，吉林 延吉 133000）

柑橘（Citrus reticulataBlanco）是我國南方栽培的重要果樹之一[1]，面積和產量較大[2]。柑橘采收后貨架期短，收獲旺季導致滯銷、腐爛等問題，造成資源浪費和經濟損失。柑橘酸甜適中，汁水豐富，適合加工果醋等制品。果醋是集營養、保健和食療等功能為一體的新型調味品[3-4]，將柑橘加工成果醋可為其加工利用提供一條新途徑。

目前柑橘果醋的研究報道較多，主要集中在對柑橘果醋發酵條件、發酵基質、發酵方式、風味成分及微生物多樣性等方面。孫娜[5]采用三種發酵方式對柑橘醋發酵品質及微生物多樣性進行了研究，結果固態發酵菌群較液態發酵豐富；楊馨悅等[6]優化了柑橘果醋液態表面和液態深層發酵工藝；楊宇馳等[7]比較研究了一次和二次發酵對柑橘果醋品質的影響，結果一次發酵周期比二次發酵長；王炳宇等[8]研究了不同發酵基質柑橘果醋揮發性成分的差異。CHEN Y等[9]對混菌發酵柑橘果醋進行了研究；HU F F等[10]對柑橘果醋沉淀的化學成分、形成機理及抗增殖作用進行了研究。但有關不同醋酸菌及發酵方式對柑橘果醋品質的影響尚少見報道。

本研究以柑橘為原料，采用滬釀1.01、AS1.41和許氏醋酸菌三種醋酸菌，通過一次發酵、二次發酵兩種發酵方式分別制備6種柑橘果醋，并通過分析這6種果醋理化指標，比較其品質差異，旨在探討不同醋酸菌及發酵方式對柑橘果醋品質的影響，為柑橘果醋產業化技術研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司；滬釀1.01醋酸菌：上海釀造科學研究所；AS1.41醋酸菌：中國普通微生物菌種保藏管理中心；許氏醋酸菌（Acetobacter schutzenbachii）：浙江臨海市利民化工有限公司；果膠酶（酶活50 000 U/g）：德國三顆星食品公司；食用酒精（酒精度85%vol）：牡丹江白酒廠；柑橘果酒（酒精度6%vol）、柑橘果汁（可溶性固形物為10.8°Bx）：實驗室自制。

甲醇、乙腈、冰醋酸、磷酸（均為色譜純）：北京邁瑞達有限公司；草酸、DL-酒石酸、L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸、琥珀酸、沒食子酸、（+）-兒茶素、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、白藜蘆醇、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、槲皮素標準品（純度均＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；其他化學試劑（分析純及生化試劑）：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S分析天平：塞多利斯（中國）科技有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器：日本TOMY公司；TDZ5-WS高速離心機：湖南湘儀實驗儀器有限公司；CM-5色差儀：北京柯尼卡美能達投資有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀、L-8900氨基酸分析儀：日本島津公司；Promosil C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：博納艾杰爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌液體培養基

滬釀1.01醋酸菌液體培養基：1%葡萄糖和1%酵母浸膏用蒸餾水溶解，121 ℃滅菌20 min，使用前加入4%食用酒精。

AS1.41醋酸菌液體培養基：10%葡萄糖和1%酵母浸膏用蒸餾水溶解，121 ℃滅菌20 min，使用前加入4%食用酒精。

許氏醋酸菌液體培養基[11]：1%葡萄糖和1%酵母膏，121 ℃滅菌20 min，使用前按體積分數3%加入無水乙醇。

1.3.2 柑橘果醋實驗設計

本實驗采用種醋酸菌及兩種發酵方式制備六種柑橘果醋，其代號及發酵液組成見表1。

表1 六種柑橘果醋實驗設計Table 1 Experimental design of six kinds of citrus fruit vinegar

1.3.3 柑橘果醋加工工藝流程及操作要點

（1）一次發酵法

（2）二次發酵法

（3）二次發酵法操作要點

柑橘去皮、榨汁、柑橘去皮榨汁后用120目的濾布過濾。

酶解：濾汁按照10 kg柑橘添加1 g果膠酶進行常溫酶解4 h。

調糖：酶解結束后添加白砂糖，調整糖度為20°Bx。

酵母菌活化：取活性干酵母加入10倍35～38 ℃無菌蒸餾水攪拌溶解，在此溫度水浴活化20～30 min。

酒精發酵：在柑橘果汁中加入0.02%活化后的酵母，置20～24 ℃室溫條件下發酵至酒精度為12%vol左右。

醋酸菌活化：將醋酸菌接入液體培養基，在30 ℃恒溫培養至醋酸菌菌落數＞108CFU/m L。

醋酸發酵：柑橘果酒用蒸餾水稀釋至酒精度為6%vol，按10%（V/V）接種量接種醋酸菌，于32 ℃條件下發酵，每隔12 h取樣測定醋酸含量，醋酸含量不再增加時結束發酵。

果醋殺菌：70 ℃條件下殺菌30 min。

陳釀：常溫下陳釀貯存3個月。

（4）一次發酵法操作要點

柑橘果汁90 ℃恒溫殺菌30 min，待溫度冷卻至室溫，將原果汁用蒸餾水稀釋至50%后加入食用酒精至酒精度為6%vol，按10%（V/V）接種量接種醋酸菌。其他操作要點同二次發酵法。

1.3.4 柑橘果汁和果醋品質指標測定

總酸、蛋白質測定：分別采用GB 12456—2021《食品中總酸的測定》和GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》；總糖測定：采用苯酚-硫酸法[12]；總多酚測定：采用Folin-Ciocalteu法[13]；總黃酮測定：采用閆慧君等[14]的方法；單體酚測定：采用孫翔宇等[15]的高效液相色譜法，其色譜條件如下：Promosil C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL；采用梯度洗脫，流動相A：乙腈-冰乙酸（98∶2，V/V），流動相B：水-冰乙酸（98∶2，V/V）。有機酸含量測定：采用GB 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》；氨基酸測定：參考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。柑橘果醋顏色參數L*值（明亮度）、a*值（紅色度）、b*值（黃色度）測定：采用湯曉宏等[16]的方法；透光率測定：采用程浩[17]的方法。

1.3.5 數據分析

實驗數據通過Excel2016和SPSS22.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同醋酸菌和發酵方式對柑橘果醋總酸的影響

不同醋酸菌和發酵方式對柑橘果醋總酸含量的影響結果見圖1。由圖1可知，在酒精含量為6%vol的條件下，不同醋酸菌對總酸含量影響無顯著差異（P＞0.05），但發酵快慢不同，滬釀1.01醋酸菌發酵最快，許氏醋酸菌最慢，AS1.41醋酸菌居中，這與3種醋酸菌發酵特性有關，滬釀1.01醋酸菌將乙醇發酵為乙酸的能力最強，許氏醋酸菌最弱，AS 1.41醋酸菌介于二者之間。3種醋酸菌二次發酵比一次發酵得快，這與發酵底物有關，醋酸菌將乙醇氧化為乙酸的能力很強，而將葡萄糖氧化為葡萄糖酸的能力很弱，一次發酵底物中有果汁，其葡萄糖含量高于二次發酵，氧化代謝糖需要時間長一些，所以發酵得慢。這說明發酵菌種及發酵方式對醋酸發酵快慢均有一定的影響。

圖1 不同醋酸菌及發酵方式對6種柑橘果醋發酵過程中總酸含量的影響Fig.1 Effects of different acetic acid bacteria and fermentation methods on total acid contents in six kinds of citrus vinegar samples

2.2 不同醋酸菌和發酵方式對柑橘果醋總糖、總多酚、總黃酮、蛋白質及單體酚含量的影響

不同醋酸菌和發酵方式對柑橘果醋總糖、總多酚、總黃酮及蛋白質含量的影響結果見表2。

表2 不同柑橘醋酸菌及發酵方式對6種果醋總糖、總酚、總黃酮及蛋白質含量的影響Table 2 Effects of different acetic acid bacteria and fermentation methods on total sugar,total phenols,total flavones and protein contents in six kinds of citrus vinegar samples

由表2可知，同種發酵方式3種菌種相比，總多酚、總黃酮、蛋白質含量呈現出相同的規律，AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌＞許氏醋酸菌，且存在顯著性差異（P＜0.05）。總糖含量均為許氏醋酸菌＞AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌。同種醋酸菌兩種發酵方式相比，總糖、總多酚、總黃酮、蛋白質含量一次發酵法均顯著高于二次發酵法（P＜0.05）。

10種單體酚標準品標準曲線回歸方程及相關系數見表3。由表3可知，10種單體酚標準品在質量濃度10～300 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數R2均＞0.999。

表3 10種單體酚標準品標準曲線回歸方程及相關系數Table 3 Regression equation and correlation coefficient of standard curves of ten free phenols standards

6種柑橘果醋中單體酚含量測定結果見表4。由表4可知，6種柑橘果醋均檢測出10種單體酚，單體酚含量與總多酚、總黃酮、蛋白質含量順序一致，同種發酵方式3種醋酸菌相比，單體酚總含量高低依次為AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌＞許氏醋酸菌，且存在顯著性差異（P＜0.05）。同種醋酸菌兩種發酵方法相比，單體酚含量一次發酵法顯著高于二次發酵法。分析原因主要與發酵底物有關，一次發酵底物是酒精度為6%vol食用酒精的果汁，二次發酵底物是用蒸餾水稀釋酒精度為6%vol酒精的發酵酒，果汁中總糖、總多酚、總黃酮、蛋白質含量高于稀釋酒，另外二次發酵的果醋多酚和黃酮等發生氧化水解，多酚含量降低[18]，所以一次發酵醋高于二次發酵醋。

表4 6種柑橘果醋中單體酚含量測定結果Table 4 Determination results of ten free phenols in six kinds of citrus vinegar mg/L

同種發酵方式3種醋酸菌相比，AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌＞許氏醋酸菌，可能與3種醋酸菌對這些成分代謝能力不同有關。AS1.41醋酸菌對單體酚、總多酚、總黃酮、蛋白質代謝能力低于滬釀1.01醋酸菌和許氏醋酸菌，而對糖的代謝能力高于滬釀1.01但低于許氏醋酸菌。

10種單體酚主要分為酚酸類化合物和類黃酮物質，沒食子酸，綠原酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸屬于酚酸類化合物[19]，兒茶素、表兒茶素、蘆丁和槲皮素等屬于類黃酮[20]。采用AS1.41醋酸菌一次發酵的果醋中咖啡酸、綠原酸、對香豆酸和蘆丁含量高于其他5種果醋，兒茶素和槲皮素含量也較高，這與AS1.41醋酸菌發酵特性及一次發酵底物中含有原果汁有關。

2.3 不同醋酸菌和發酵方式對柑橘果醋有機酸的影響

6種有機酸標準品標準曲線回歸方程及相關系數見表5。由表5可知，6種有機酸質量濃度和檢測峰面積相關性較好，標準曲線回歸方程相關系數R2均≥0.999 4。

表5 6種有機酸標準品標準曲線回歸方程及相關系數Table 5 Regression equation and correlation coefficient of standard curves of six organic acid standards

6種柑橘果醋中有機酸含量測定結果見表6。由表6可知，6種柑橘果醋均含有6種有機酸，且有機酸總含量高低依次為PCV101＞PCV141＞SCV141＞PCVAS＞SCV101＞SCVAS，其中一次發酵法有機酸總含量高低依次為PCV101＞PCV141＞PCVAS，二次發酵法有機酸總含量高低依次為SCV141＞SCV101＞SCVAS，說明滬釀1.01和AS1.41菌種有機酸總含量均高于許氏醋酸菌，一次發酵法有機酸總含量高于二次發酵法，這與發酵底物以及3種醋酸菌發酵特性不同有關。

表6 6種柑橘果醋中有機酸含量測定結果Table 6 Determination results of organic acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/L

從單一有機酸含量來看，6種柑橘果醋均是檸檬酸＞酒石酸＞琥珀酸＞蘋果酸＞乳酸＞草酸（AS1.41菌種二次發酵蘋果酸與乳酸例外），且均具有顯著性差異（P＜0.05）。檸檬酸是柑橘中含量最高的酸，果醋中檸檬酸含量高在一定程度上緩解乙酸刺激性氣味，使柑橘果醋味道變得柔和豐滿[21-22]。

2.4 不同醋酸菌和發酵方式對柑橘果醋氨基酸含量的影響

6種柑橘果醋中氨基酸含量測定結果見表7。由表7可知，6種果醋分別檢測出17種氨基酸，其中7種為必需氨基酸，這說明柑橘果醋中氨基酸含量比較豐富，主要來源包括原果汁中含有氨基酸、發酵過程中果實中蛋白質降解為氨基酸以及醋酸菌代謝釋放出的氨基酸[23]。6種柑橘果醋的總氨基酸（total amino acid，TAA）和非必需氨基酸（non-essential amino acid，NAA）含量高低依次為PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCV101＞SCVAS；而EAA含量高低依次為PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCVAS＞SCV101，即采用1.41醋酸菌一次發酵的6種果醋TAA、必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、NAA含量均為最高，分別為1 830.10 mg/kg、420.80 mg/kg和1 409.30 mg/kg；一次發酵法TAA、EAA、NAA含量均顯著高于二次發酵法（P＜0.05），可能是由于二次發酵過程中游離氨基酸通過Strecker降解的緣故[24]。

表7 6種柑橘果醋中氨基酸含量測定結果Table 7 Determination results of amino acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/kg

氨基酸的種類與含量不同，對果醋的風味品質也有一定的影響。6種柑橘果醋呈味氨基酸含量測定結果見表8。由表8可知，鮮味氨基酸主要包括天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸；甜味氨基酸主要包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、組氨酸和脯氨酸；苦味氨基酸主要包括纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸；芳香族氨基酸主要有酪氨酸和苯丙氨酸[25]。鮮、甜、苦、香4種呈味氨基酸含量及其總含量高低均為PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCV101＞SCVAS，且具有顯著性差異，均是AS1.41＞滬釀1.01＞許氏醋酸菌。4種呈味氨基酸含量高低相比，均是甜味氨基酸＞鮮氨基酸＞苦氨基酸＞芳香族氨基酸。

表8 6種柑橘果醋呈味氨基酸含量測定結果Table 8 Determination results of flavor amino acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/kg

2.5 不同醋酸菌和發酵方式對柑橘果醋色澤和透光率的影響

由表9可知，6種柑橘果醋除了個別果醋，明亮度和澄清度均為二次發酵法顯著高于一次發酵法（P＜0.05），黃色度一次發酵法高于二次發酵法，由于柑橘醋是黃色的所以紅色度均很低。不同醋酸菌對果醋L*值、a*值、b*值和澄清度的影響顯著（P＜0.05）。

表9 6種柑橘果醋顏色參數及透光率的比較Table 9 Comparison of color parameters and light transmittance of six kinds of citrus vinegar

3 結論

本研究以柑橘為原料，采用3種醋酸菌（滬釀1.01、AS1.41、許氏醋酸菌）兩種液態發酵方式（一次發酵法、二次發酵法）共發酵6種柑橘果醋。對6種柑橘果醋總酸、總糖、總多酚、總黃酮、有機酸、單體酚、氨基酸含量及果醋顏色、澄清度等理化指標進行了綜合分析。結果表明，采用AS1.41醋酸菌和一次發酵法加工的果醋總多酚、總黃酮、蛋白質、單體酚、總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、呈味氨基酸含量均高于其他5種果醋，滬釀1.01和AS1.41醋酸菌一次發酵法和二次發酵法有機酸總含量均高于許氏醋酸菌。因此，AS1.41醋酸菌和一次發酵法加工的柑橘果醋最好。