高安曲,李南薇,楊泳怡,高蘇娟*,劉功良,白衛東
(1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院,廣東 廣州 510225;2.仲愷農業工程學院 現代農業工程創新研究院,廣東 廣州 510225)
金絲棗(Ziziphus jujube),屬于鼠李科棗屬植物,成熟后變紅色,有“天然維生素”的美譽,除生食外,還可煮食、熬湯或作為燉品之配料,還可制成脆棗、蜜棗、棗茶等。近年來,滄州市金絲棗產量達800萬kg。金絲棗營養豐富,維生素C含量約為蘋果的70倍[1],干果中含糖量高達70%~80%,富含蘆丁、膳食纖維、三萜酸、黃酮和酚酸等[2-4],有養胃健脾、抗衰老、抗腫瘤、軟化血管降低血壓,防治高血壓的功效[5]。檸檬(Citrus limon)為雙子葉植物綱蕓香科柑橘屬植物,我國的檸檬產量排名世界第一,占世界柑橘產業的9%。檸檬果實中富含芳香揮發成分和蘋果酸、琥珀酸、鈣、磷、檸檬苦素、維生素C和維生素P等物質[6],具有生津解暑、開胃健脾、預防和治療高血壓和心肌梗塞等功效[7]。檸檬味酸、微苦,生吃鮮食較少,多加工成檸檬片、檸檬蜜餞、檸檬茶[8]、檸檬汁[9-10]等食用。
果醋是由水果汁(漿)經酒精發酵、醋酸發酵制得的酸性飲品,既保留了水果中的大部分維生素、植物多酚等生物活性成分,也獲得了微生物發酵產生的有機酸等成分,因而形成了其獨特的營養和風味,備受消費者青睞[11]。國內外利用果蔬等原料發酵果醋的相關研究越來越多,蘇偉等[12]以搖瓶發酵法制備的蘋果醋與酶解法制備的棗汁進行調配制成金絲棗蘋果醋復合飲料,確定了其最佳配方。郭夢瑤等[13]從柿子醋醋醅中分離木醋桿菌(Acetobacter xylinum)并應用于冬棗醋的研制,確定了最佳醋酸發酵條件。郭靜婕[6]研究不同發酵條件對香蕉檸檬復合果醋產酸量的影響,確定了香蕉檸檬復合果醋最適發酵工藝條件。將金絲棗和檸檬制成復合果醋,不僅克服了單一原料發酵果醋的風味、色澤的缺陷,起到風味互補的作用,還發揮兩者維生素C含量均較高的營養特色。
本研究以金絲棗和檸檬為主要原料制備金絲棗檸檬復合果醋,采用單因素試驗及正交試驗分別探究了金絲棗、檸檬的酶解工藝條件,金絲棗和檸檬果汁的體積比以及酒精發酵和醋酸發酵的工藝條件,以期為紅棗和檸檬精深加工提供有益的參考,為紅棗檸檬復合果醋產品研發及產業化發展提供理論依據。
1.1.1 原料與菌株
金絲棗:市售;檸檬:廣東中興綠豐發展有限公司;葡萄酒果酒專用酵母SY[1]:安琪酵母股份有限公司;醋酸菌干粉[14]:煙臺帝伯仕酵母有限公司。
1.1.2 試劑
果膠酶(酶活為10 000 U):上海萬康生物科技有限公司;氫氧化鈉、抗壞血酸、磷酸鹽緩沖液、酒石酸鉀鈉、碳酸氫鈉、次甲基藍、五水硫酸銅(均為分析純):上海源葉生物科技有限公司。
DHP-9012型電熱恒溫培養箱、HG-9620A電熱鼓風干燥箱、THZ-103B恒溫培養搖床、HWS12型電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學儀器有限公司;WK2102型電磁爐、MJ-BL25B2攪拌機:廣東美的生活電器制造有限公司;ST2200ZH-B型pH計:奧豪斯儀器(上海)有限公司;JJ3000型電子天平:廣州市正一科技有限公司;722可見分光光度計:上海佑科儀器儀表有限公司;LDZX-30FBS立式蒸汽滅菌鍋:上海申安醫療器械廠。
1.3.1 金絲棗檸檬復合果醋制備工藝流程及操作要點

操作要點:
金絲棗汁的制備:金絲棗干果經去核后進行復水處理,按料液比1∶8(g∶mL)加水浸泡10 h[15],瀝干水分,以料液比1∶4(g∶mL)加水并加熱煮沸15 min至果肉軟爛,冷卻至室溫打漿1 min[16]。添加0.03%的果膠酶,45 ℃酶解時間2 h,酶解后,85 ℃水浴10 min滅酶[5],4層紗布過濾,獲得濾液,即得金絲棗汁。
檸檬汁的制備:檸檬鮮果用清水洗凈,100 ℃熱燙30~60 s去除雜菌,洗凈去皮去核,破碎榨汁,添加0.025%的果膠酶,45 ℃酶解4 h,酶解后,85 ℃水浴10 min滅酶[5],4層紗布過濾,獲得濾液,即得檸檬汁。
混合、調配:將金絲棗汁與檸檬汁以體積比5∶5進行混合,使調配果汁酸甜適宜、口味協調。
酒精發酵:稱取安琪果酒酵母0.02 g,加入至100 mL混合果汁中,于40 ℃水浴活化30 min后接種至混合果汁中,在28 ℃靜置發酵6 d[17],發酵至酒精度不再上升,即得復合果酒發酵液(酒精度為6%vol)。
醋酸發酵:稱取0.04%的醋酸菌干粉,直接加入復合果酒發酵液中混勻后,置于搖床32 ℃,150 r/min發酵7 d,發酵液酸度不再上升即為終點,發酵結束后總酸含量為21.71g/L。
過濾、滅菌、澄清、罐裝:醋酸發酵液用紗布過濾,所得濾液于80 ℃水浴25 min滅菌[18],經自然澄清、罐裝即可得金絲棗檸檬復合果醋成品。
1.3.2 酶解工藝優化
(1)金絲棗酶解工藝優化
單因素試驗:分別考察果膠酶添加量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)、酶解時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h)、酶解溫度(30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)和酶解pH值(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)對金絲棗出汁率的影響。
正交試驗:在單因素試驗的基礎上,以金絲棗出汁率為考察指標,以果膠酶添加量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)和酶解pH值(D)為影響因素,設計L9(34)正交試驗,確定金絲棗酶解條件的最佳工藝參數。
(2)檸檬汁酶解工藝優化
單因素試驗:分別考察果膠酶添加量(0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%、0.035%)、酶解時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h)、酶解溫度(30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)和酶解pH值(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)對檸檬出汁率的影響。
正交試驗:在單因素試驗的基礎上,以果膠酶添加量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)和酶解pH值(D)作為影響因素,以檸檬汁出汁率為評價指標,設計L9(34)正交試驗,確定檸檬酶解條件的最佳工藝參數。
1.3.3 金絲棗汁與檸檬汁體積比的確定
將制得的金絲棗汁與檸檬汁按照體積比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進行混合,并根據感官評分標準進行感官評價,確定金絲棗汁與檸檬汁體積比對混合果汁感官評分的影響。
1.3.4 酒精發酵工藝條件優化
單因素試驗:以殘糖含量、酒精度為考察指標,固定培養條件為28 ℃靜置培養6 d,分別考察初始糖度(14°Bx、16 °Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx)、酵母菌接種量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)和初始pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)對金絲棗檸檬復合果醋酒精發酵效果的影響。
正交試驗:在單因素試驗的基礎上,以酒精度為考察指標,以初始糖度(A)、酵母菌接種量(B)、初始pH值(C)作為影響因素,設計L9(33)正交試驗,探究金絲棗檸檬復合果醋酒精發酵最佳工藝條件。
1.3.5 醋酸發酵工藝優化
單因素試驗:以感官評價為考察指標,依次考察初始pH值(2.5、3.0、3.5、4.0及4.5)、醋酸菌接種量(0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)和初始酒精度(5.0%vol、6.0%vol、7.0%vol、8.0%vol、9.0%vol)對金絲棗檸檬復合果醋醋酸發酵效果的影響。
正交試驗:在單因素試驗結果的基礎上,以感官評價為考察指標,初始酒精度(A)、醋酸菌接種量(B)和初始pH值(C)為影響因素,設計L9(33)正交試驗,考察3因素對金絲棗檸檬復合果醋醋酸發酵效果的影響。
1.3.6 測定方法
(1)理化指標的測定
酒精度的測定:參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的酒精計法[19];總糖的測定:采用直接滴定法[20];總酸的測定:參照GB/T 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》的酸堿滴定法[21];pH值的測定:采用pH計。
酶解后原料出汁率依據下式[22]進行計算:

式中:m1為酶解后所得果汁質量,g;m2為果膠酶添加量,g;m3為酶解前果漿質量,g。
(2)感官評價
金絲棗檸檬復合果汁的感官評價:參考李璐等[18]制定的評分標準結合金絲棗汁和檸檬汁的特點,制定金絲棗與檸檬復合果汁的感官評價標準見表1,請10名專業品評人員從色澤和外觀、香氣、滋味方面對金絲棗檸檬復合果汁進行感官評價。

表1 金絲棗檸檬復合果汁感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of golden-silk jujube and lemon compound juice
金絲棗檸檬復合果醋的感官評價:10名專業品評人員依據色澤、滋味和氣味、組織狀態、含雜質情況對金絲棗檸檬復合果醋進行感官評價[23-24],滿分為100分,感官評分標準見表2。

表2 金絲棗檸檬復合果醋感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of golden-silk jujube and lemon compound vinegar
1.3.7 數據處理
所有數據重復3次,數據均以“平均值±標準差”表示,使用SPSS 22.0進行數據分析,用Origin 9.0進行繪圖。
2.1.1 金絲棗酶解工藝條件優化單因素試驗結果
果膠酶分解果膠、瓦解植物細胞壁,有利于可溶性固形物的溶出[25],酶解處理可顯著提高金絲棗汁出汁率,減少金絲棗汁中抗壞血酸和總酚損失[26],本試驗探究了果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度和酶解pH值對金絲棗出汁率的影響,結果見圖1。
由圖1A可知,果膠酶添加量在0.01%~0.03%范圍內增加,金絲棗出汁率逐漸升高;當果膠酶添加量為0.03%時,金絲棗出汁率最高,為93.87%;當果膠酶添加量>0.03%之后,金絲棗出汁率降低。因此,最適果膠酶添加量為0.03%。由圖1B可知,當酶解時間在1~3 h范圍內增加,金絲棗出汁率逐漸增加;當酶解時間為3 h時,金絲棗出汁率達到最大值,為93.34%;當酶解時間>3 h之后,金絲棗出汁率逐漸降低。因此,最適酶解時間為3 h。由圖1C可知,酶解溫度在30~45 ℃范圍內增加,金絲棗出汁率明顯提高;當酶解溫度為45 ℃時,金絲棗出汁率最高,為93.85%;酶解溫度>45 ℃之后,金絲棗出汁率則呈下降趨勢,這是由于溫度高于45 ℃,果膠酶活性降低,不利于底物轉化[27]。因此,最適酶解溫度為45 ℃。由圖1D可知,當酶解pH值在2.5~4.0范圍內增加,金絲棗出汁率明顯提高;當酶解pH值為4.0時,金絲棗出汁率達到最大值,為93.32%;當酶解pH值>4.0之后,金絲棗出汁率逐漸下降,原因可能是pH過低或過高會破壞果膠酶的結構和功能。因此,最適酶解pH值為4.0。

圖1 果膠酶添加量(A)、和酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶解pH(D)對金絲棗出汁率的影響Fig.1 Effect of pectinase addition(A),enzymolysis time(B),temperature(C)and pH(D)on golden-silk jujube juice yield
2.1.2 金絲棗酶解工藝條件優化正交試驗結果與分析
在單因素試驗的基礎上,以金絲棗出汁率為考察指標,選取果膠酶添加量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶解pH值(D),設計L9(34)正交試驗優化金絲棗酶解工藝條件,正交試驗結果與分析見表3。

表3 金絲棗酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization of golden-silk jujube juice
由表3可知,根據R值得出影響金絲棗酶解出汁率的4個因素的主次順序為:C>D>B>A,即酶解溫度>酶解pH>酶解時間>果膠酶添加量。根據k值,得出最優金絲棗酶解條件組合為A2B2C2D3,即果膠酶添加量0.03%、酶解pH值3.5、45 ℃條件下水解3 h,在該工藝條件下進行3次平行驗證試驗,金絲棗出汁率達到93.9%,較未經酶解的對照組金絲棗出汁率(78.88%)提高了15.02%。結果表明,對金絲棗酶解條件進行優化可以提高金絲棗出汁率。
2.2.1 檸檬酶解工藝條件優化單因素試驗結果
檸檬中果膠含量高達25%左右[28],導致檸檬汁黏度較高,直接榨汁出汁率較低,因此本試驗采用果膠酶水解檸檬的果膠物質,并探究果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度以及酶解pH值對檸檬出汁率的影響,結果見圖2。
由圖2A可知,當果膠酶添加量為0.010%~0.025%,檸檬出汁率上升顯著;果膠酶添加量為0.025%時,檸檬出汁率最高,為89.12%;果膠酶添加量>0.025%之后,酶解出汁率上升趨勢不明顯。因此,最適果膠酶添加量為0.025%。由圖2B可知,當酶解時間為1~3 h時,檸檬出汁率逐漸增加;當酶解時間為3 h時,檸檬出汁率最高,為89.11%;當酶解時間>3 h之后,檸檬出汁率下降。因此,最適酶解時間為3 h。由圖2C可知,當酶解溫度為30~40 ℃時,檸檬出汁率逐漸增加;當酶解溫度為40 ℃時,檸檬出汁率達最高值,為88.94%;當酶解溫度>40 ℃之后,檸檬出汁率下降。因此,最適酶解溫度為40 ℃。由圖2D知,當酶解pH值為2.5~4.0時,檸檬出汁率逐漸增加;當酶解pH值為4.0時,檸檬出汁率最高,為89.23%;當酶解pH值>4.0之后,檸檬出汁率下降。因此,最適酶解pH值為4.0。

圖2 果膠酶添加量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶解pH(D)對檸檬出汁率的影響Fig.2 Effect of pectinase addition (A),enzymolysis time (B),temperature (C) and pH (D) on lemon juice yield
2.2.2 檸檬酶解工藝條件優化正交試驗結果與分析
在單因素試驗的基礎上,以檸檬出汁率為考察指標,選取果膠酶添加量(A)、酶解時間(B)、酶解溫度(C)、酶解pH值(D),設計L9(34)正交試驗優化檸檬酶解工藝條件,正交試驗結果與分析見表4。

表4 檸檬酶解條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization of lemon
由表4可知,根據R值,影響檸檬酶解出汁率的4個因素的主次關系為A>C>B>D,即果膠酶添加量>酶解溫度>酶解時間>酶解pH值。根據k值,得出最優檸檬酶解條件的組合為A3B2C3D3,即果膠酶添加量0.020%,酶解時間3 h,酶解溫度45 ℃,酶解pH值4.5。以此優化工藝條件下,進行3次平行驗證試驗,檸檬出汁率達90.04%,較未酶解的對照組檸檬出汁率提高了9.91%。
金絲棗汁和檸檬汁體積比對感官評分的影響見圖3。

圖3 金絲棗汁和檸檬汁體積比對復合果汁感官評分的影響Fig.3 Effect of volume ratio of golden-silk jujube juice and lemon juice on sensory scores of compound juice
由圖3可知,當金絲棗汁和檸檬汁體積比在1∶9~7∶3之間,隨著混合汁中金絲棗汁的占比增大,感官評分隨之升高;當金絲棗汁和檸檬汁體積比為7∶3時,感官評分最高,為90分;但金絲棗汁和檸檬汁體積比超過7∶3時,感官評分則呈下降趨勢。故確定金絲棗汁和檸檬汁混合的最佳體積比為7:3。
2.4.1 酒精發酵工藝條件優化單因素試驗結果
酒精發酵是果醋發酵的關鍵環節,本試驗探究了初始糖度、酵母菌接種量和初始pH值對金絲棗檸檬復合果汁酒精發酵效果的影響,結果見圖4。

圖4 初始糖度(A)、酵母菌接種量(B)、初始pH(C)對金絲棗檸檬復合果汁酒精發酵的影響Fig.4 Effect of initial sugar content (A),yeast inoculum (B),initial pH(C) on alcoholic fermentation of golden-silk jujube and lemon compound juice
由圖4A可知,隨著初始糖度在14~22°Bx范圍內增加,殘糖含量顯著增加。隨著初始糖度在14~18°Bx范圍內增加,發酵液中酒精度顯著增加;當初始糖度為18°Bx時酒精度達到最高,為8.3%vol;當始糖度>18°Bx,酒精度下降。初始糖度越高,高滲透作用對酵母生長抑制越明顯[29],表現為殘糖含量增加,酒精度下降,且發酵液渾濁,酒精氣味刺鼻。綜上所述,最適初始糖度為18°Bx。由圖4B可知,酵母菌接種量在0.01%~0.05%范圍內增加,殘糖含量一直呈下降趨勢。隨著酵母菌接種量在0.01%~0.03%范圍內增加,酒精度逐漸增加;酵母菌接種量為0.03%時,酒精度達最高值,為8.8%vol;酵母菌接種量>0.03%,發酵液酒精度降低,這可能是由于酵母接種量過高,發酵液中營養物質大量被消耗而影響了酒精發酵[30],綜上所述,最適酵母接種量為0.03%。由圖4C可知,隨著初始pH值在3.5~5.5范圍內增加,殘糖含量逐漸增加,初始pH值>4.5,殘糖含量上升更明顯。隨著初始pH值在3.5~4.5范圍內增加,酒精度逐漸增加;初始pH值>4.5之后,發酵液中酒精度則明顯降低;初始pH值為5.5時,無法測出酒精度,表明該pH條件不適于酵母發酵。通過顯著性分析結果顯示,初始pH值為4.0和4.5時,發酵液酒精度無顯著性差異(P<0.05),為進一步細化酒精發酵的最適初始pH值,選擇初始pH值為4.00、4.25、4.50進行正交試驗。
2.4.2 酒精發酵工藝條件優化正交試驗結果與分析
在單因素試驗基礎上,以酒精度為評價指標,考察初始糖度(A)、酵母菌接種量(B)、初始pH值(C)對酒精發酵效果的影響,設計3因素3水平的正交試驗,正交試驗結果與分析見表6。

表6 酒精發酵工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests results for alcoholic fermentation technology optimization
由表6可知,以酒精度為評價指標,根據R值,影響發酵液酒精發酵階段酒精度的3個因素的主次關系為:初始糖度(A)>初始pH值(C)>酵母菌接種量(B)。根據k值,得到酒精發酵階段最佳工藝條件的組合為A3B3C3,即初始糖度20°Bx,酵母菌接種量0.04%,初始pH值4.0。在此優化條件下進行驗證試驗,釀造得到的金絲棗檸檬復合果酒殘糖含量為3.86 g/L,酒精度為9.00%vol。
2.5.1 醋酸發酵工藝條件優化單因素試驗結果
醋酸菌以酒精為主要底物發酵產醋酸[31],發酵產物的總酸含量與發酵時間息息相關,而發酵時間又直接受菌株接種量的影響[32]。因此,本試驗考察了初始酒精度、醋酸菌接種量、初始pH值對金絲棗檸檬果酒醋酸發酵效果的影響,其結果見圖5。

圖5 初始酒精度(A)、醋酸菌接種量(B)、初始pH值(C)對紅棗檸檬復合果酒醋酸發酵的影響Fig.5 Effect of initial alcohol content (A),acetic acid bacteria inoculum(B),and initial pH (C) on acetic fermentation of golden-silk jujube and lemon compound alcoholic beverage
由圖5A可知,當初始酒精度在5.0%vol~6.0%vol范圍內增加時,感官評分逐漸增加;當初始酒精度為6.0%vol時,感官評分最高,為76.5分;當初始酒精度>6.0%vol之后,感官評分略有下降。當初始酒精度在5.0%vol~9.0%vol范圍內,總酸含量均呈增加趨勢,由21.35 g/L提高至28.71 g/L,綜合考慮,最適初始酒精度為6.0%vol。
由圖5B可知,醋酸菌接種量在0.02%~0.04%范圍內增加,金絲棗檸檬復合果醋感官評分有所增加;當醋酸菌接種量為0.04%,感官評分最高,為76.6分,當醋酸菌接種量>0.04%之后,感官評分整體呈下降趨勢。在醋酸菌接種量在0.02%~0.06%范圍內增加,金絲棗檸檬復合果醋總酸含量逐漸增加;當醋酸菌接種量為0.06%,總酸含量最高,為30.68 g/L,當醋酸菌接種量>0.06%,總酸含量下降。綜合考慮,最適醋酸菌接種量為0.04%。
由圖5C可知,初始pH值在2.5~4.5范圍內增加,總酸含量顯著下降。當發酵液初始pH值在2.5~4.0范圍內增加,感官評分逐漸增加;初始pH值為4.0時,感官評分達到最大,為70.8分;初始pH值>4.0之后,感官評分逐漸下降。因此,最適pH值為4.0。
2.5.2 醋酸發酵工藝條件優化正交試驗結果與分析
在單因素試驗基礎上,以感官評分為評價指標,考察初始酒精度(A)、醋酸菌接種量(B)、初始pH(C)對醋酸發酵效果的影響,設計3因素3水平的正交試驗,正交試驗結果與分析見表7。

表7 醋酸發酵工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation process conditions optimization
由表7可知,根據極差值R,影響感官評分的3個因素的主次關系為初始pH值(C)>醋酸菌接種量(B)>初始酒精度(A)。根據k值,得到最優醋酸發酵階段工藝條件組合是A2B3C3,即初始酒精度6.0%vol,醋酸菌接種量0.06%,初始pH值4.5。在此優化條件下進行3次平行驗證試驗,釀造金絲棗檸檬復合果醋感官評分達81.2分,總酸含量為18.01 g/L,符合NY/T 2987—2016《綠色食品 果醋飲料》要求[33]。
本試驗以金絲棗與檸檬為原料發酵制備金絲棗檸檬復合果醋,分別確定了金絲棗與檸檬的最佳酶解條件,將酶解后的金絲棗汁和檸檬汁以7∶3(V/V)混合后,調整初始pH值4.0,初始糖度20°Bx,添加SO2含量75 mg/L,以0.04%接種量接種安琪酵母SY,28 ℃發酵6 d,然后進行醋酸發酵,即初始pH值4.5,初始酒精度6%vol,醋酸菌接種量0.06%,32 ℃發酵7 d,制得金絲棗檸檬復合果醋。金絲棗檸檬復合果醋感官評分為81.2分,醋體呈黃橙色,口感酸甜適宜,狀態均一、穩定,無懸浮物,風味協調。其總酸(以乙酸計)含量為18.01 g/L,符合NY/T 2987—2016《綠色食品 果醋飲料》要求。