氣相色譜-內標法測定白酒中3種高級脂肪酸乙酯含量

畢榮宇，喬敏莎，盧 君*，唐 平，山其木格，王 麗，王 凡，李長文

（1.貴州國臺酒業集團股份有限公司，貴州 遵義 564501；2.天士力控股集團有限公司研究院，天津 300410）

中國白酒作為世界六大蒸餾酒之一，歷史悠久，風格獨特[1-2]。其主要成分除占98%的乙醇和水外，還含有2%的醇、酸、酯、醛和其他芳香族化合物等微量成分[3-6]。其中含量較高的棕櫚酸乙酯（ethyl palmitate，EP）、油酸乙酯（ethyl oleate，EO）和亞油酸乙酯（ethyl linoleate，EL）并稱為白酒中的三大高級脂肪酸乙酯[7]。這3種高級脂肪酸乙酯不溶于水，溶于乙醇，沸點高，不易揮發[8-10]。3種高級脂肪酸乙酯是白酒的重要風味物質，它們可以增加酒的厚重感，減少干澀，增強后味[11]。這些物質在酒體中的穩定性與酒精度、在酒精中的溶解度以及環境溫度密切相關，相關研究表明，3種高級脂肪酸乙酯的含量在低度酒中超過2 mg/L時，就會造成白酒酒體渾濁，影響白酒質量[12-13]。因此，很多酒類企業為了保障產品的透明度，會嚴格控制其含量或者在工藝環節直接去除。白酒中3種高級脂肪酸乙酯的準確定量是監管與控制的前提。

目前，3種高級脂肪酸乙酯的檢測方法在相關的國家標準和行業標準中都未涉及，文獻報道的方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[14-16]和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用法。劉奕霏等[7]建立了白酒中3種高級脂肪酸乙酯的氣相色譜-質譜聯用檢測方法，結果表明，該方法可成為白酒真偽鑒定和案件串并溯源工作的一項重要技術手段。左國營等[8]利用GC-MS對白酒中油狀物質進行了定性分析，通過對比分析發現，樣品中的己酸乙酯、棕櫚酸乙酯和亞油酸乙酯含量相對較大，是造成白酒降度渾濁的主要因素。徐軍[17]對濃香型枝江白酒香味成分進行研究，結果表明，摘酒度數越低，蒸餾過程中后段酒高級脂肪酸乙酯含量越高。李凱敏[18]采用優化后的頂空固相微萃取條件（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）對特香型原酒樣品進行萃取，進行GC-MS分析，結果表明，特香型白酒風味成分中響應值較高的峰均為棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和油酸乙酯等乙酯類物質，證明了酯香是特香型白酒的主體風味。NIU Y W等[19]采用氣相色譜-嗅覺測量法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和GC-MS對中國茅臺酒中的31種酯類香氣成分進行了鑒定，采用液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）和HS-SPME兩種方法提取后，采用GC-MS對其進行了定量分析，其中棕櫚酸乙酯的含量在11.888 0～12.009 0 mg/L之間。MA L H等[20]利用HS-SPME和同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）結合GC-MS和GC-O對致中和五加皮藥酒中的風味物質進行了分析，其中棕櫚酸乙酯的含量為0.806 1 mg/L。WANG J S等[21]利用現代分離技術和分子感官評價方法揭示了濃香型白酒中的香氣化合物，詳細介紹了棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯等46種酯類化合物的研究進展。

本研究以乙酸正戊酯為內標物，建立了白酒中棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯的氣相色譜（GC）檢測方法，并探究了市售不同香型白酒、不同品牌醬香型白酒中3種高級脂肪酸乙酯的含量分布規律，為定性、定量分析白酒中3種高級脂肪酸乙酯提供準確、有效的檢測方法。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與試劑

不同香型白酒酒樣（共11種）（編號為醬香型7-2#、濃香型8-5#、清香型7-1#、老白干香型7-3#、芝麻香型8-6#、豉香型7-4#、鳳香型8-1#、兼香型8-3#、米香型7-5#、董香型8-2#、馥郁香型8-4#；不同品牌醬香型白酒酒樣（共35種）（編號為JT9-1#～JT9-5#、LT12-1#～LT12-5#、GT10-1#～GT10-5#、DT13-1#～DT13-5#、XT14-1#～XT14-5#、MT15-1#～MT15-5#、ZT17-1#～ZT17-5#）：市售。

棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯（純度均＞97%）、乙醇（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；乙酸正戊酯（純度99.5%）：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

Thermo trace 1310氣相色譜（GC）儀（配備AI-1310自動進樣器）、Gen Pure xCAD Plus純水機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；ME204T電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent HP-FFAP色譜柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

3種高級脂肪酸乙酯和乙酸正戊酯儲備液：分別準確稱取棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯140.1 mg、133.6 mg、144.8 mg，用體積分數53%乙醇溶液定容至20 mL；乙酸正戊酯稱取1.762 9 g，用體積分數53%乙醇溶液定容100 mL。棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯的質量濃度分別為6.935 0 mg/mL，6.546 4 mg/mL，7.002 8 mg/mL；乙酸正戊酯的質量濃度為0.175 4 mg/mL。

3種高級脂肪酸乙酯中間液：分別準確移取3種高級脂肪酸乙酯儲備液5 mL至50 mL容量瓶中，用體積分數53%乙醇溶液定容。棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯的質量濃度分別為0.693 5 mg/mL、0.654 6 mg/mL、0.702 3 mg/mL。

3種高級脂肪酸乙酯標準溶液：移取不同體積的中間液（0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、1.00 mL、4.00mL、6.00 mL），用體積分數53%乙醇溶液定容至10 mL，質量濃度分別為0.0030mg/mL、0.0070mg/mL、0.017 0mg/mL、0.070 0 mg/mL、0.2700mg/mL、0.3900mg/mL。

1.3.2 樣品前處理

取酒樣混勻后放置磨口玻璃瓶內待用。準確量取酒樣5.00 mL于10 mL具塞磨口離心管中，加入內標乙酸正戊酯標準溶液50 μL，混勻，供GC分析。

1.3.3 儀器檢測條件

色譜條件：色譜柱為Agilent HP-FFAP色譜柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；進樣口溫度240 ℃；分流進樣，分流比1∶25；分流流量為75.0 mL/min；吹掃流量2.0 mL/min；橫流模式；流速為3 mL/min；程序升溫為初始柱溫37 ℃，保持7 min，以3.5 ℃/min升溫至45.0 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升溫至80 ℃，保持0 min；再以10 ℃/min升溫至100 ℃，保持4 min；再以20 ℃/min升溫至180 ℃，保持0 min；再以15 ℃/min升溫至200 ℃，保持20 min；載氣為氮氣（N2）；檢測器為氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）；檢測器溫度為250 ℃；進樣量1 μL。

2 結果與分析

2.1 標準品的測定

取一定濃度的3種高級脂肪酸乙酯混合溶液進行氣相色譜分析，通過每種高級脂肪酸乙酯的標準樣品確定其保留時間結果見圖1。

由圖1可知，3種高級脂肪酸乙酯均可以檢出，乙酸正戊酯（內標）、棕櫚酸乙酯（EP）、油酸乙酯（EO）和亞油酸乙酯（EL）的保留時間分別為18.287 min、34.957 min、39.853 min、41.438 min，各物質色譜峰可以達到完全分離（R＞1.5），能實現良好的分離。

圖1 3種高級脂肪酸乙酯與乙酸正戊酯的標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 3 kinds of higher fatty acid ester and n-amyl acetate standard

2.2 方法的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限與定量限

準確量取100 μL乙酸正戊酯內標溶液加入不同質量濃度的3種高級脂肪酸乙酯標準溶液中，混合均勻。以3種高級脂肪酸乙酯質量濃度（x）為橫坐標，3種高級脂肪酸乙酯峰面積與內標乙酸正戊酯峰面積比（y）為縱坐標，繪制標準曲線，利用0.003 0 mg/mL的質量濃度水平為依據，3倍信噪比（S/N=3）計算檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N=10）計算定量限（limit of quantitation，LOQ），得到3種高級脂肪酸乙酯的標準曲線線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限，結果見表1。由表1可知，3種高級脂肪酸乙酯在各自質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）均≥0.999 2。棕櫚酸乙酯（EP）、油酸乙酯（EO）、亞油酸乙酯（EL）的檢出限分別為0.003 4 mg/mL、0.003 2 mg/mL、0.003 5 mg/mL，定量限分別為0.011 6 mg/mL、0.010 9 mg/mL、0.011 7 mg/mL，本方法具有較低的檢出限與定量限，靈敏度能夠滿足白酒中高級脂肪酸乙酯的檢測需求。

表1 3種高級脂肪酸乙酯的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限與定量限Table 1 Linear equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 3 kinds of higher fatty acid esters

2.3 加標回收率與精密度試驗

準確移取10 mL的酒樣，分別按照低、中、高三個水平添加高級脂肪酸乙酯標準溶液，按照樣品前處理方法進行處理并測定高級脂肪酸乙酯的含量，每個質量濃度平行測定6次，計算高級脂肪酸乙酯的平均加標回收率和精密度試驗相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表2。

表2 3種高級脂肪酸乙酯加標回收率與精密度試驗結果Table 2 Results of standard recovery rate and precision tests of 3 kinds of higher fatty acid esters

由表2可知，3種高級脂肪酸乙酯的平均加標回收率為90.10%～116.97%，精密度試驗結果的RSD為2.19%～4.65%，表明該方法回收率高，準確度良好，符合白酒中棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和亞油酸乙酯的分析檢測要求。

2.4 白酒樣品的高級脂肪酸乙酯檢測

2.4.1 不同香型白酒樣品的高級脂肪酸乙酯檢測

酯類物質是白酒香味的重要組成部分，3種高級脂肪酸乙酯不僅在白酒的呈香過程也起著助香和呈味的作用，在酒體內以不同的強度釋放香氣，有助于形成白酒的復合香氣，形成獨特風格的特點，而且是評價白酒質量優劣的最直觀的指標之一[22-23]。利用實驗所建立的分析方法，對不同香型白酒中高級脂肪酸乙酯含量進行測定，每個樣品平行測定3次，計算平均值，檢測結果見表3。

表3 不同香型白酒高級脂肪酸乙酯含量測定結果Table 3 Determination results of higher fatty acid ethyl esters contents of different flavor Baijiu mg/mL

由表3可知，11種不同香型白酒樣品中，除豉香型白酒未檢測出3種高級脂肪酸乙酯外，其余10種香型白酒均檢測出3種高級脂肪酸乙酯。其中棕櫚酸乙酯含量最高的是醬香型白酒，含量為0.029 2 mg/mL，油酸乙酯含量最高的是老白干香型，含量為0.012 6 mg/mL，亞油酸乙酯含量最高的是醬香型白酒，含量為0.020 5 mg/mL。綜合對比3種高級脂肪酸乙酯總量，總含量最高的白酒是醬香型白酒，含量為0.062 2 mg/mL，其次是老白干香型和鳳香型白酒，含量分別為0.053 9 mg/mL和0.050 9 mg/mL。高級脂肪酸乙酯屬于高沸點物質，醬香型白酒獨特的“四高”生產工藝及原料中氮元素含量高可能是其高級脂肪酸乙酯含量較高的原因之一，而豉香型白酒含量較低也可能與其原料中有機氮源和脂肪含量較少有關[10，24-25]。

2.4.2 不同品牌醬香型白酒樣品的高級脂肪酸乙酯檢測

在研究的基礎上，醬香型白酒中3種高級脂肪酸乙酯的含量較高。因此實驗選取了市售不同醬香型品牌共計35種醬香型白酒進行3種高級脂肪酸乙酯含量的對比分析，結果見表4。

表4 不同品牌醬香型白酒中高級脂肪酸乙酯含量測定結果Table 4 Determination results of higher fatty acid ethyl esters content in different brands of sauce-flavor Baijiu mg/mL

由表4可知，醬香型白酒的3種高級脂肪酸乙酯的總含量在0.003 5～0.075 8 mg/mL之間。其中MT15-1白酒樣品中只檢測到了亞油酸乙酯，其余醬香型白酒樣品均檢測到3種高級脂肪酸乙酯。XT品牌醬香型白酒中所含3種高級脂肪酸乙酯的含量均明顯低于其他品牌醬香型白酒，這也可能是XT品牌醬香型白酒口味較寡淡的原因之一。檢測結果表明，3種高級脂肪酸乙酯在醬香型白酒中普遍存在，特別是溫度降低后會出現絮狀渾濁[26-27]，因此，白酒企業還是要不斷的提高3種高級脂肪酸乙酯的監測能力，控制其含量，避免出現渾濁，影響白酒的質量。

3 結論

白酒酒尾水油狀物的主要成分為高級脂肪酸乙酯，通過其含量的控制也可以實現酒尾的再利用，制成高酸高酯的調味酒，為企業增加效益。因此，對其準確定量顯得尤其重要。采用氣相色譜（GC）結合內標法，建立了3種高級脂肪酸乙酯的檢測方法，并對11種不同香型白酒及不同品牌醬香型白酒中高級脂肪酸乙酯的含量進行了測定。結果表明，該方法能使3種高級脂肪酸乙酯得到很好的分離，3種高級脂肪酸乙酯在各自質量濃度范圍內線性關系良好，線性范圍為0.003 0～0.400 0 mg/mL，相關系數（R2）均＞0.999，精密度試驗結果相對標準偏差均＜5%，平均加標回收率為94.01～116.97%，檢出限為0.003 2～0.003 5 mg/mL，定量限為0.010 9～0.011 7 mg/L。對市售11種不同香型白酒中的3種高級脂肪酸乙酯含量進行測定，除豉香型白酒未檢測出3種高級脂肪酸乙酯外，其余10種香型白酒均能檢出，其中，醬香型白酒含量最高。同時對市售35種不同品牌醬香型白酒中的3種高級脂肪酸乙酯含量進行測定，其總含量在0.003 5～0.075 8 mg/mL之間。該方法準確、靈敏度高，能對白酒中3種高級脂肪酸乙酯進行有效分析，可用于酒類企業日常白酒分析工作，通過控制其含量，避免酒體出現渾濁，影響白酒的質量。