HPLC法測定復方保健酒中人參皂苷和西紅花苷的含量

胡 楊，李先芝，2*，嚴 玲，毛瓊麗，劉 洋，朱 艷，石 豪

（1.勁牌有限公司，湖北 黃石 435100；2.中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435100）

保健酒是將我國酒文化和中藥文化有機結合的產物，是我國特有的現象。保健酒是以白酒為基酒，以單味或多味中藥材為原料，精制而成的一種具有某些功能性的酒。隨著我國經濟社會的發展，人們生活水平的提高，消費者越來越注重健康的生活方式，保健酒愈發受到消費的青睞。因此，保健酒成為眾多研究者和學者的研究對象。謝洪等[1-2]以青錢柳為原料，探究了青錢柳保健酒的生產工藝，確認最佳的工藝條件。許明君等[3]以肉蓯蓉、枸杞子、紅參、菟絲子等4味藥材為原料，研究出了具有增強免疫力的復方中藥保健酒。與此同時，那廣寧等[4]以苦瓜汁與蘋果菠蘿混合果汁為原料研究出了一種發酵型苦瓜保健酒，研究結果表明，該保健酒具有一定的抗氧化活性。

復方保健酒是以多種中藥材為原料，以中藥材的配伍合理性為基礎而研究的保健酒[5-7]。本文研究的復方保健酒是以人參、西紅花、葛仙米3味藥材為原料，經過數字化提取精制而成的具有提高免疫力的保健酒?，F代醫學研究結果表明人參在抗炎[8-9]、增強免疫力[10-11]、降血脂[12]、護肝[13-14]、保護腎臟[15-16]、提高心臟功能[17]等方面具有顯著效果。西紅花苷是西紅花的主要成分，在保護心臟、腎臟、肝臟[18-21]等方面有顯著作用。目前，對人參皂苷及西紅花苷的含量檢測研究較多[22-25]，但關于復方保健酒中人參皂苷及西紅花苷的檢測研究甚少。該研究將人參皂苷和西紅花苷作為復方保健酒的標志性成分，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對復方保健酒中的標志性成分人參皂苷、西紅花苷進行檢測，為后期生產過程中的質量監控及評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參皂苷Rg1（批號：110703-201933，含量：93.4%）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202028，含量：93.1%）、人參皂苷Rb2（批號：111715-201203，含量：93.8%）、西紅花苷I（批號：111588-201704，含量：88.4%）、西紅花苷II：（批號：111589-201705，含量：92.2%）：中國食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rc（批號：CFS201901，含量：98%）：ChemFaces公司。

乙腈（HPLC級）：美國Fisher公司；水為超純水。

3批復方保健酒由勁牌有限公司提供。

1.2 儀器與設備

UltiMate 3000高效液相色譜儀：美國賽默飛公司；SQP電子分析天平：德國賽多利斯公司；SK1200H 數控超聲波清洗儀：上?？茖С晝x器有限公司；RE-2002旋轉蒸發儀：鄭州科達機械儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備

精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II對照品適量，加50%甲醇溶解，制成1 mL中含有人參皂苷Rg10.39 mg、人參皂苷Rb10.42 mg、人參皂苷Rb20.42 mg、人參皂苷Rc 0.41 mg、西紅花苷I 0.22 mg、西紅花苷II 0.24 mg的混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液制備

精密量取人參保健酒樣品50 mL，置于茄形瓶中，于55 ℃條件下旋轉蒸發至近干，用體積分數為50%甲醇溶解樣品，定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得。

1.3.3 色譜條件

（1）人參皂苷含量檢測色譜條件

色譜柱：Agilent Sb-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫見表1；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm；進樣量10 μL。

表1 人參皂苷含量檢測梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for ginsenoside content detection

（2）西紅花苷含量檢測色譜條件

色譜柱：Agilent Sb-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫見表2；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長440 nm；進樣量10 μL。

表2 西紅花苷含量檢測梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for crocin content detection

1.3.4 人參皂苷及西紅花苷含量的測定

根據人參皂苷及西紅花苷對照品在色譜圖上的保留時間對復方保健酒的人參皂苷及西紅花苷進行定性分析，同時以對照品濃度與樣品峰面積的比值，依據標準曲線得到各物質的含量。計算公式如下：

式中：cx為樣品質量濃度，mg/L；cr為對照品質量濃度，mg/L；Ax為樣品峰面積，mAU·s；Ar為對照品峰面積，mAU·s。

1.3.5 數據分析

利用儀器自帶的軟件Chromeleon7用于查看色譜圖、繪制標準曲線，利用Excel 2019軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系試驗考察

將“1.3.1”項下對照品溶液稀釋成5個不同濃度水平的對照品混合溶液，按照“1.3.3”項色譜條件下進樣測定，以物質質量濃度（X）為橫坐標，相對應的色譜峰面積（Y）為縱坐標建立標準曲線，得出線性關系及范圍，結果見表3。由表3可知，各成分在各自范圍內線性關系良好，相關系數R均＞0.999。

表3 各成分的標準曲線回歸方程及線性關系Table 3 Standard curve regression equation and linear relationships of various constituents

2.1.2 人參皂苷和西紅花苷成分HPLC色譜圖

在“1.3.3”項色譜條件下將對照品及樣品進行進樣測定，色譜圖見圖1及圖2。結果顯示，對照品及樣品在相同時間下均有色譜峰出現，表明復方保健酒中含有人參皂苷及西紅花苷。

圖1 人參皂苷成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ginsenoside components

圖2 西紅花苷成分HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of crocin composition

將樣品于190～500 nm波長范圍內進行掃描，掃描結果見圖3。由圖3可知，西紅花苷I、西紅花苷II在波長440 nm處有較大的的吸收峰，因此將440 nm作為西紅花苷成分的檢測波長；而人參皂苷在波長190～210 nm區間范圍內有較大的響應，但隨著波長的增大，響應值逐漸減小，因此對人參皂苷成分進行不同波長下（190 nm、230 nm）進樣檢測，結果見圖4。

圖3 不同波長條件下西紅花苷及人參皂苷掃描圖譜Fig.3 Scanning profile of crocin and ginsenoside under different wavelength conditions

圖4 不同波長下人參皂苷色譜圖Fig.4 Chromatograms of ginsenosides at different wavelengths

由圖4可知，當檢測波長為190 nm時色譜峰的基線不平，當檢測波長為203 nm時，基線平穩，故選擇203 nm作為人參皂苷的檢測波長。

2.1.3 精密度試驗

取同一酒樣，按照1.3.2供試品溶液制備方法制備供試品，人參皂苷按1.3.3項下人參皂苷含量檢測色譜條件進行連續進樣6次，記錄峰面積；西紅花苷按“1.3.3”項下西紅花苷含量檢測色譜條件進行連續進樣6次，檢測結果見表4。由表4可知，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.85%、0.74%、1.22%、0.66%、0.43%、0.73%，均＜5%，表明該儀器精密度良好。

表4 各成分含量的精密度試驗測定結果Table 4 Precision test results of each component

2.1.4 穩定性試驗

取同一酒樣，人參皂苷檢測按“1.3.3”項下人參皂苷含量檢測色譜條件分別于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、18 h進樣，記錄峰面積，檢測結果見表5；西紅花苷檢測按“1.3.3”項下西紅花苷含量檢測色譜條件分別于0 h、3 h、5 h、8 h、12 h、16 h進樣，記錄峰面積，檢測結果見表6。由表5表6可知，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II峰面積測定結果的RSD值分別為0.86%、1.11%、1.47%、1.26%、1.05%、1.12%，表明供試品溶液中人參皂苷在室溫放置18 h內穩定性良好，西紅花苷在室溫條件下16 h內穩定性良好。

表5 人參皂苷各成分的穩定性試驗結果Table 5 Stability test results of each component of ginsenoside

表6 西紅花苷各成分的穩定性試驗結果Table 6 Stability test results of each component of crocin

2.1.5 重復性試驗

取同一酒樣，按照“1.3.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品6份，分別按“1.3.3”項下色譜條件進行進樣，記錄含量，檢測結果見表7。結果表明，測得人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II峰面積測定結果的RSD值分別為1.73%、0.75%、1.12%、0.67%、0.36%、0.23%，均＜5%，表明該方法重復性良好。

表7 各成分重復性試驗數據Table 7 Repeatability test results of each component

2.1.6 加標回收率試驗

精密量取已知含量的同一酒樣25 mL至茄形瓶中，共9份，分別按照酒樣中各成分含量的低、中、高三個水平加入對照品適量，分別按“1.3.3”項下色譜條件進行測定，計算各成分加標回收率，結果見表8。由表8可知，各成分平均加標回收率分別為人參皂苷Rg199.15%、人參皂苷Rb1101.72%、人參皂苷Rb2100.64%、人參皂苷Rc 100.52%、西紅花苷I 99.36%、西紅花苷II 97.83%。加標回收率的RSD值分別為3.15%、1.75%、2.83%、3.42%、2.98%、3.37%，均＜5%，表明該方法準確度高。

表8 樣品中各成分的加標回收率試驗結果Table 8 Recovery rates tests results of each component in the samples

2.2 樣品含量測定

取3批次復方保健酒樣品，按照“1.3.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品，分別按“1.3.3”項下色譜條件進行進樣，計算各批次復方保健酒樣品中各成分的含量，含量測定結果見表9。由表9可知，3批次的復方保健酒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II含量的RSD值均＜2%，表明復方保健酒的生產工藝較穩定。

表9 樣品中人參皂苷和西紅花苷含量的測定結果Table 9 Determination results of ginsenoside and crocin contents of samples

3 結論

本研究建立了HPLC法測定復方保健酒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、西紅花苷I、西紅花苷II的含量的方法，該方法操作簡便，重復性好，準確度高，可為后期復方保健酒生產過程中的質量監控及評價提供參考依據。