白靈菇褐腐病防治藥劑藥效評價

初占宇，賈培松，，羅 影，努爾孜亞·亞力買買提，付永平，李 玉

(1.吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，長春 130118；2.新疆農業科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】白靈側耳(Pleurotustuoliensis)又稱白靈菇，隸屬于擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬[1-2]。白靈菇目前已實現產業化[3-4]。2010年我國白靈菇年產量高達323 713 t，2018年年產量55 832 t。在2010～2018年中白靈菇的病害也逐年上升，其中有細菌斑點病、菌褶滴水病、細菌性腐爛病、紅菇病等細菌性病害[5]。新疆白靈菇主產區細菌性褐腐病普遍發生，嚴重時發病率達90%以上[6-7]。白靈菇褐腐病在嚴重季節可達90%～95%。在自然條件下，白靈菇子實體在發病初期子實體菌蓋表面呈現水漬狀病癥，病變部分呈暗黃褐色，菌蓋表面形成一薄層菌濃，有淡淡的臭味。發病中期，水漬狀癥狀逐漸擴大，約占子實體表面的1/2，病變部分顏色逐漸加重，呈深褐色，臭味逐漸加重。發病后期，水漬狀癥狀會蔓延至整個子實體，嚴重影響白靈菇的產量。該病的病原菌為托拉斯假單胞菌Pseudomonastolaasii，篩選出高效的防治藥劑對減少細菌性腐爛病有實際意義。【前人研究進展】農業防治主要是通過改善栽培環境，加強栽培各流程的管理，降低白靈菇細菌性褐斑病發病率[6-7]。農業防治包括栽培場所的周邊環境、栽培場所的衛生情況、白靈菇栽培料的配方、栽培過程中菌種的制作、栽培袋接種發菌、出菇管理、采摘管理等[8-10]。Fermor[13]從菇場、土壤、植物材料上分離出了一批P.tolaasii的拮抗細菌，這些細菌能顯著降低褐斑病的發病程度，具有很高應用價值和研究價值。Soler-Rivas[14]發現Pseudomonasreactans產生的WLIP(white line inducing principle)能中和tolaasin毒素，在褐斑病生物防治中具有應用開發的潛力。Tsukamoto[15]從已經腐爛的糙皮側耳子實體上分離到一株革蘭氏陽性細菌，該細菌能顯著降低托拉斯假單胞菌P.tolaasii產生tolaasin的概率。呂銳玲等[16]從大蒜、蒲公英和魚腥草中篩選出大蒜粗提液對糙皮側耳褐斑病病原細菌菌株PH-1具有顯著抑菌作用，但發揮作用的物質以及抑菌機制尚需進一步研究。劉芹等[17]發現殼聚糖對托拉斯假單胞菌生長具有較好的抑制作用。【本研究切入點】針對白靈菇細菌性褐斑病，目前尚沒有非常有效的化學防治藥劑。四環素、鏈霉素、漂白粉液和二氧化氯等，化學藥劑在實際防治過程中，效果都不是特別理想[11-12]。目前生物防治方面的研究主要集中在篩選拮抗菌和tolaasin毒素降解等。該病的病原菌有關藥劑防治未見報道。【擬解決的關鍵問題】選取20種殺菌劑測定其對白靈菇褐腐病病原菌的毒力，篩選出高效、低毒和環境友好型殺菌劑，為有效防治該病害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

5株白靈菇褐腐病分離菌株，菌株編號分別為XJ2-3、XJ2-10、XJ4-6、XJ4-11、XJ7-2，分離自烏魯木齊縣和青河縣的白靈菇感病子實體，并經柯赫氏法則驗證致病性，菌株現保存于吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心(CCMJ)和新疆農業科學院植物保護研究所。表1

表1 供試菌株信息

1.1.2 培養基

LB營養瓊脂培養基：酵母膏10 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

LB液體培養基：酵母膏10 g，胰蛋白陳10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 供試藥劑

從市場上選取20種常用殺菌劑，劑型包括可濕性粉劑、水分散粒劑、懸浮劑、乳油、可溶液劑、水劑、水乳劑。表2

表2 20種供試殺菌劑信息

1.2 方 法

1.2.1 菌懸液制備

將病原菌菌株活化出現的單菌落，接種至200 mL LB液體培養基中，用記號筆標記接種人、接種日期及接種菌株編號，28℃ 150 r/min條件下，恒溫震蕩培養箱暗培養16 h，備用。將紫外分光光度計在450 nm處將吸光度調整為0.3。通過涂布平板法(取少量菌懸液滴加于LB固體培養基上，用滅過菌的涂布器，將菌液均勻的涂布在培養基表面)適當稀釋的LB固體培養基上的活細胞計數，并將其放在28℃恒溫培養箱中暗黑培養48 h。細菌菌懸液濃度(1.3±0.2)×108CFU / mL。

1.2.2 藥劑初篩

用無菌水按照重量/體積比(或體積/體積比)將各供試藥劑稀釋300倍，備用。取配置好的菌懸液100 μL涂布于直徑為9 cm的LB營養瓊脂培養基平板上，將滅菌后的紙碟放置于平板培養基正中間，吸取100 μL藥劑加至紙碟上，對照組添加100 μL無菌水，于28℃恒溫箱中暗培養3 d，每個處理3次重復。記錄紙碟周圍有無明顯抑菌現象，采用十字交叉法測量抑菌圈大小，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(處理組抑菌圈直徑-紙碟直徑)/處理組抑菌圈直徑×100%。

1.2.3 藥劑濃度梯度

將初篩出來的殺菌劑設置300、500、700、900、1 100倍稀釋液5個濃度稀釋梯度和150、300、450、600、750倍稀釋液5個濃度梯度，采用紙碟法測定各殺菌劑在不同濃度梯度下的抑菌圈直徑，每個處理梯度重復3次，計算抑菌率。

1.3 數據處理

利用 SPSS 軟件計算各殺菌劑毒力回歸方程、相關系數(r)和抑菌率的大小以對各殺菌劑的毒力大小進行評價[18]。

2 結果與分析

2.1 白靈菇褐腐病病害防治藥劑初篩

研究表明，46%二氯異氫尿酸鈉、32%唑酮·乙蒜素對白靈菇褐腐病菌具有明顯的抑制作用。100×108cfu/g枯草芽孢桿菌、60%唑醚·代森辛、50%烯酰嗎啉、50%硫磺、50%咪鮮胺錳鹽等18種殺菌劑對白靈菇褐腐病菌無明顯的抑制作用。圖1

圖1 部分藥劑初篩

2.2 二氯異氫尿酸鈉藥劑濃度梯度評價

研究表明，在稀釋濃度為300倍下，二氯異氫尿酸鈉抑菌率區間為36%～62%，在同樣的稀釋濃度下，不同菌株之間存在一定差異。在稀釋濃度為300倍下，XJ7-2的抑制率明顯高于其他4個菌株，但隨著稀釋濃度逐漸增大，抑菌率逐漸變小，在稀釋濃度為1 100倍下，5個菌株的抑菌率區間僅為7%～29%。抑菌率越大藥劑毒力越強。藥劑二氯異氫尿酸鈉在稀釋濃度300倍下，抑菌效果最為明顯。表3

2.3 唑酮·乙蒜素藥劑濃度梯度評價

研究表明，在稀釋濃度為150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率區間為41%～50%，在稀釋濃度為150倍下，XJ4-6的抑菌率為50%，抑制率明顯高于其他4個菌株。隨著稀釋濃度逐漸增大，抑菌率逐漸減小。當稀釋濃度為750倍下，抑制率區間為3%～16%。隨著稀釋濃度逐漸增大，抑菌率逐漸變小。故藥劑唑酮·乙蒜素在稀釋濃度150倍下，抑菌效果最為明顯。表4

表3 46%二氯異氫尿酸鈉對白靈菇褐腐病菌的毒力回歸方程

3 討 論

針對白靈菇褐腐病室內及田間化學防治藥劑的篩選迫切重要[19-20]。選擇新疆地區常用的20種商品殺菌藥劑對白靈菇褐腐病菌進行室內抑菌，試驗初篩得到抑菌效果較好的2種殺菌藥劑，并將2種殺菌劑采用紙碟法分別進行室內毒力顯示，在稀釋濃度為150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率區間為41%～50%，在稀釋濃度為300倍下，二氯異氫尿酸鈉抑菌率區間為40%～62%，2種藥劑殺菌效果皆明顯，且2種商品藥劑又都屬于高效、低毒和環境友好型殺菌劑，可作為后續田間藥劑防治試驗的首選藥劑。在采取農藥防治的同時根據不同的實際情況選擇合適的農業防治措施配合防治，如從培育和引進抗性品種、增強品種的抗病性、及時清除病殘體等全方面防控措施[21-23]。

表4 32%唑酮·乙蒜素對白靈菇褐腐病菌的毒力回歸方程

防控中也應避免單一藥劑的多年重復施用，可將此次篩選出的2種藥劑復配、交替使用，得到較理想的田間防控效果。

4 結 論

篩選獲得在稀釋濃度為150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率區間為41%～50%，在稀釋濃度為300倍下，二氯異氫尿酸鈉抑菌率區間為36%～62%，2種藥劑殺菌效果皆明顯。唑酮·乙蒜素和二氯異氫尿酸鈉作為白靈菇褐腐的防治藥劑。

參考文獻(References)

[1] 戴玉成, 曹云, 周麗偉, 等. 中國靈芝學名之管見[J]. 菌物學報, 2013, 32(6): 947-52.

DAI Yucheng, CAO Yun, ZHOU Liwei, et al. Notes on the nomenclature of the most widely cultivated Ganoderma species in China [J].Mycology, 2013, 32(6): 947-52.

[2] 曹瑤, 聞紹鋒, 劉書暢, 等. 白靈菇研究進展綜述[J]. 食藥用菌, 2019, 27(3): 169-73.

CAO Yao, WEN Shaofeng, LIU Shuchang, et al. Research progress ofPleurotustuoliensis.[J].EdibleandMedicinalMushrooms,2019, 27(3): 169-73.

[3] 華霜. 低溫脅迫白靈菇原基形成過程中DNA甲基化變異及調控基因研究[D]. 長春：吉林農業大學, 2017.

HUA Shuang.DNAMethylationVariationandRegulatorygenesResearchDuringthePleurotustuoliensisPrimordiumFormationInducedbyLowTemperature[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2017.

[4] 靖云閣. 白靈側耳菌絲生理成熟期環境控制及生理指標測定[D].北京：中國農業科學院, 2018.

JING Yunge.StudiesofEnvironmentControlandPhysiologicaltestduringPleurotustuoliensisinMyceliumPhysiologicalMaturityPeriod[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2018.

[5]牟川靜, 曹玉清, 馬金蓮. 阿魏側耳一新變種及其培養特征[J]. 真菌學報, 1987, (3): 153-6.

MOU Chuanjing, CAO Yuqing, MA Jinlian.Pleurotuseryngii(Dc. ex Fr.) Quel. var. tuoliensis [J].ChineseJournalofMycosystema, 1987, (3): 153-6.

[6] 蘭紅禮. 白靈菇生理性病害的診斷與防治方法[J]. 中國園藝文摘, 2018, 34(3): 200-1.

LAN Hongli. Diagnosis and control methods of physiological diseases ofPleurotustuoliensis[J].ChineseHorticulturalDigest, 2018, 34(3): 200-1.

[7] 周序清. 白靈菇工廠化栽培技術要點[J]. 北京農業, 2012, (33): 44.

ZHOU Xuqing. Key points of industrialized cultivation techniques ofPleurotustuoliensis[J].BeijingAgriculture, 2012, (33): 44.

[8]Li R, Zheng Q, Lu J, et al. Chemical composition and deterioration mechanism ofPleurotustuoliensisduring postharvest storage[J].FoodChemistry, 2021, 338.

[9] Ruirong L, Qianwang Z, Jiali L, et al. Chemical Composition And Deterioration Mechanism OfPleurotustuoliensisDuring Postharvest Storage[J].FoodChemistry, 2021, 338.

[10] Zou Y, Du F, Hu Q, et al. Integration ofPleurotustuoliensiscultivation and biogas production for utilization of lignocellulosic biomass as well as its benefit evaluation[J].BioresourceTechnology, 2020, 317.

[11]劉川. 平菇褐斑病發生的環境因素分析和抗性材料篩選[D].武漢： 華中農業大學, 2012.

LIU Chuan.AnalysisofenvironmentalfactorsandscreeningofresistantmaterialsforP.ostreatusbrownspot[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2012.

[12]劉國宇. 耐高溫型平菇菌株篩選與關鍵栽培技術研究[D].北京：中國農業科學院, 2012.

LIU Guo-yu.ScreeningofhightemperatureresistantPleurotusostreatusstrainsandkeycultivationtechniques[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2012.

[13]Fermor T R, Lynch J M. Bacterial blotch disease of the cultivated mushroom Agaricusbisporus: screening, isolation and characterization of bacteria antagonistic to the pathogen (Pseudomonastolaasii)[J].JournalofAppliedBacteriology, 1988, 65(3).

[14] Soler-Rivas C, Arpin N, Olivier J-M, et al. The effects of tolaasin, the toxin produced by Pseudomonas tolaasiion tyrosinase activities and the induction of browning inAgaricusbisporusfruiting bodies [J].PhysiologicalandMolecularPlantPathology, 1999, 55(1).

[15] Murata H, Tsukamoto T, Shirata A. rtpA , a gene encoding a bacterial two-component sensor kinase, determines pathogenic traits of Pseudomonas tolaasii , the causal agent of brown blotch disease of a cultivated mushroom,Pleurotusostreatus[J].Mycoscience, 1998, 39(3).

[16] 呂銳玲, 熊慧婷, 葉子茂, 等. 糙皮側耳褐斑病病原菌的鑒定及生物防治[J]. 食用菌學報, 2021, 28(1): 97-102.

LV Ruiling, XIONG Huiting, YE Zimao, et al.The identification and biological control of brown ear brown spot pathogen [J].JournalofEdibleFungi, 2021,28(1) : 97-102.

[17] 劉芹, 宋志波, 崔筱, 等. 殼聚糖對平菇褐斑病病原菌的抑制作用及機理[J]. 中國食用菌, 2020, 39(9): 88-93.

LIU Qin, SONG Zhibo, CUI Xiao, et al. The inhibitory effect and mechanism of chitosan onPleurotusostreatusbrown spot pathogen [ J ].ChineseEdibleFungi, 2020,39(9): 88-93.

[18] 張德勝, 張永超, 喬奇, 等. 10種殺菌劑對甘薯黑斑病的毒力及聯合毒力[J]. 農藥, 2012, 51(6): 452-4.

ZHANG Desheng, ZHANG Yongchao, QIAO Qi, et al. 10 fungicides on sweet potato black spot toxicity and joint toxicity [J].Pesticides, 2012, 51(6) : 452-4.

[19] Cameron A, Sarojini V.Pseudomonassyringaepv. actinidiae: chemical control, resistance mechanisms and possible alternatives[J].PlantPathology, 2014, 63(1):

[20] Serizawa S, Ichikawa T, Takikawa Y, et al. Occurrence of bacterial canker of kiwifruit in Japan: description of symptoms, isolation of the pathogen and screening of bactericides [J].AnnalsofthePhytopathologicalSocietyofJapan, 1989, 55(4): 427-36.

[21] 張學武, 宋曉斌, 馬松濤. 獼猴桃細菌性潰瘍病防治技術研究[J]. 西北林學院學報, 2000, (4): 68-72.

ZHANG Xuewu, SONG Xiaobin, MA Songtao. Research on control technology of kiwifruit bacterial canker [J].JournalofNorthwestForestryUniversity, 2000, (4): 68-72.

[22] 李瑤, 承河元, 錢子華, 等. 獼猴桃潰瘍病防治研究[J]. 安徽農業大學學報, 2001, 28(2): 139-43.

LI Yao, CHENG Heyuan, QIAN Zihua, et al. Research on control of kiwifruit canker [ J ].JournalofAnhuiAgriculturalUniversity, 2001,28(2): 139-43.

[23] 王西銳, 李永武, 雷玉山, 等. 獼猴桃潰瘍病防治研究[J]. 陜西農業科學, 2011, 57(4): 93-5.

WANG Xirui, LI Yongwu, LEI Yushan, et al. Research on control of kiwifruit canker [ J ].ShaanxiAgriculturalSciences, 2011,57(4): 93-5.