伊犁馬PFKM基因表達及酶活性分析

王 潔，孟 軍,2，曾亞琦,2，王建文,2，吐爾遜江·吾木爾艾力，王川坤，袁鑫鑫，王彤亮，姚新奎,2

(1.新疆農業大學動物科學學院/新疆農業大學馬產業研究院，烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運動生理重點實驗室，烏魯木齊 830052；3.新疆伊犁哈薩克自治州畜牧總站，新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】伊犁馬環境適應性和抗病力極強，耐粗飼、耐寒，擁有力量與速度并存點，探究伊犁馬糖酵解具有深刻的研究意義[1-3]。在葡萄糖分子轉化利用的過程中，PFKM基因對磷酸果糖激酶的有重要影響，而磷酸果糖激酶是糖酵解過程的起點[4]。糖酵解途徑中有3個重要的限速酶，即己糖激酶(HK，hexokinases)、磷酸果糖激酶-1(PFK1，phosphofructokinase1)以及丙酮酸激酶(PK，pyruvate kinase)。在其反應中，磷酸果糖激酶(PFK)是主要的調節酶，是糖酵解途徑的起博器[5-6]。其中6-磷酸果糖激酶(6-PFK)是糖酵解過程中將ATP分解的關鍵酶[7-8]。而PFK1有3種同工酶：PFKM為肌肉型、PFKP為血小板型以及PFKL肝臟型，以四聚體或二聚體的形式參與不同組織部位的糖酵解。【前人研究進展】磷酸果糖激酶(PFKM)被證實可調節葡萄糖代謝及肌肉維持等多種生物過程，是糖酵解的一個關鍵限速酶，也是葡萄糖代謝中起決定作用的限速酶。這種酶催化Mg+、ATP依賴的果糖-6-磷酸磷酸化，并形成ADP和果糖-1，6-二磷酸以及刺激6-磷酸果糖激酶的活性來控制機體的糖酵解代謝[9]。研究證實PFKM基因的相對表達量直接影響糖酵解的反應速率，在家畜家禽和豬中已證明PFKM基因表達變化與肉質有直接的關聯性[10-12]。【本研究切入點】目前，在國內外未見關于伊犁馬組織內PFKM基因表達及酶活方面的有關研究。需研究測定PFKM基因在伊犁馬不同組織部位中的差異表達。【擬解決的關鍵問題】以伊犁馬為試驗動物，利用實時熒光定量PCR技術結合酶聯免疫吸附(Elisa)檢測手段，分析心臟、肝臟、夾肌、斜方肌、背闊肌、臀中肌、半腱肌以及腹外斜肌8種組織中PFKM基因mRNA的表達水平差異及不同組織中6-PFK的酶活規律，研究糖酵解途徑中PFKM基因以及相關酶在伊犁馬生命活動中的變化規律，為其糖酵解過程中提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

挑選年齡、體況相近的8匹伊犁馬作為試驗對象，屠宰后1 h內分別采集心臟、肝臟、夾肌、斜方肌、背闊肌、臀中肌、半腱肌以及腹外斜肌8種組織樣品，用自封袋包裝置于液氮罐-196℃保存。

1.1.2 主要試劑

Elisa試劑盒(6-磷酸果糖激酶)；C2H5OH(分析醇)國藥集團化學試劑有限公司、Trizol、氯仿北京化工廠；6×Loading Buffer北京索萊寶科技有限公司；RNase-free H2O北京天根生化科技有限公司；HyperScript III RT SuperMix for qPCR with gDNA Remover、2x S6 Universal SYBR qPCR Mix等均購自新貝(上海)生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計與合成

根據NCBI數據庫已發表的PFKM基因序列，利用prime 5軟件設計PFKM熒光定量PCR引物，其中GAPDH為其內參基因。引物由新疆康普森有限公司合成。引物使用去離子水稀釋，存于-20℃冰箱內保存。表1

表1 引物信息

1.2.2 RNA提取和cDNA合成

運用Trizol法得到伊犁馬不同組織部位中RNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整程度。根據反轉錄試劑盒(HyperScript III RT SuperMix for qPCR with gDNA Remover)的操作步驟反轉錄合成cDNA；反轉錄反應體系：RNA Template100ng-2 μg，5×RT SuperMix 4 mL，RNase-free ddH2O補充至20 mL ，DTT(0.1mol /L)2 mL；反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5s；接下來進行離心，利用超微量紫外分光光度計檢測cDNA濃度，然后用無酶水稀5倍，-20℃保存于冰箱備用。

1.2.3 目的基因實時熒光定量檢測

利用實時熒光定量PCR技術測試不同部位樣本中PFKM基因mRNA表達量；反應體系：S6 UniversaL SYBR qPCR Mix 5mL，Primer-F(10 mM)0.2 mL，Primer-R(10 mM)0.2 mL，將cDNA模板(500 ng/mL)1 mL，以及RNase-free ddH2O添加至10 mL；反應條件：在95℃時預變性30s，95℃時變性10s，60℃時退火30s，72℃延伸至45s，總共40個循環。

1.3 數據處理

熒光定量PCR的數據用2-△△Ct法檢測PFKM基因在伊犁馬不同部位中差異表達量。第一步計算伊犁馬不同組織部位目的基因和內參基因的Ct差值即目的基因與內參基因的差值，接下來利用Excel計算不同部位的△Ct平均值，肝臟部位為對照組，其他部位△Ct減去肝臟的△Ct，即△△Ct也為目的基因減去內參基因的差值，再用試驗組-△△Ct(目的基因與內參基因的差值)對照組[13]；PFKM基因mRNA相對表達量數據用SPSS Statistics26.0軟件ANOVA方差分析，并且在Excel中對數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 伊犁馬不同組織部位提取RNA完整性檢測條帶

研究表明，伊犁馬不同組織部位中提取的RNA利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶十分清晰且整齊，亮度明顯，無特別明顯的擴散現象，結果質量好。圖1

2.2 實時熒光定量RT-PCR產物的特異性

研究表明，擴增效率較高，斜率較高，分別為95.5%和96.4%，因其斜率較高，拐點鮮明，均呈“S”型，線條平緩，兩者溶解曲線顯示引物特異性和重復性較好，無引物二聚體出現及非特異性擴增產物產生，擴增曲線為人類明顯的單峰，無明顯擴增雜峰，所設計引物特異性良好，符合試驗的質量要求。圖2、圖3

注：1:夾肌；2:斜方肌；3:背闊肌；4:臀中肌；5:半腱肌；6:肝臟；7:心臟；8:腹外斜肌

圖2 PFKM基因qRT-PCR 溶解曲線和擴增曲線

圖3 GAPDH基因qRT-PCR溶解曲線和擴增曲線

2.3 PFKM基因mRNA在不同組織的相對表達

研究表明，伊犁馬PFKM基因mRNA在心臟組織中的相對表達量最高為22.88，極顯著高于其他組織(P<0.01)；夾肌組織、斜方肌組織、背闊肌組織、臀中肌組織、半腱肌組織及腹外斜肌組織中PFKM的表達量極顯著高于肝臟組織(P<0.01)；心臟組織的表達量最高，其次是半腱肌、背闊肌、腹外斜肌、臀中肌、夾肌、斜方肌；在肝臟組織中最低。圖4

圖4 伊犁馬PFKM基因mRNA在不同組織中的相對表達量

2.4 6-磷酸果糖激酶在不同組織的含量

研究表明，伊犁馬不同組織中6-PFK在心臟組織中含量為1.049 mg/L極顯著高于背闊肌、肝臟、臀中肌、半腱肌、腹外斜肌、斜方肌、夾肌(P<0.01)；而背闊肌中的含量也極顯著高于肝臟、臀中肌、腹外斜肌、半腱肌、斜方肌、夾肌(P<0.01)；臀中肌中的含量極顯著高于腹外斜肌(P<0.01)；其中臀中肌中的6-PFK顯著高于夾肌、斜方肌和肝臟(P<0.05)；半腱肌中的含量顯著高于腹外斜肌(P<0.05)；其他各組織之間含量無差異。表2

表2 6-PFK在不同組織的含量

3 討 論

在糖酵解過程中，肌肉型磷酸果糖激酶(PFKM，phosphofructokinase-muscle)已被確認是其中之一的主要調控酶，將6-磷酸果糖激酶(6-PFK)轉化為1,6-雙磷酸果糖，此過程是不可逆的。6-磷酸果糖激酶(6-PFK)主要通過PFKM基因影響糖酵解的速率，并且PFKM基因的相對表達量直接影響糖酵解的反應速率[10]。研究結果顯示，在伊犁馬的不同組織部位中，PFKM基因在心臟組織中高度表達，且6-磷酸果糖激酶的活性也最高，在伊犁馬的糖酵解代謝過程中，6-磷酸果糖激酶(6-PFK)的含量可能是PFKM基因的標志代謝物。PFKM基因在伊犁馬的糖酵解過程中造成的生理及生化的具體規律尚未明晰。對PFKM基因利用熒光定量qRT-PCR檢測，開展相應的研究，證實PFKM基因對6-磷酸果糖具有相對較高的親和力[14]。試驗研究與以上相關實驗結果一致，通過熒光定量qRT-PCR對伊犁馬的PFKM基因的表達與6-磷酸果糖激酶(6-PFK)進行檢測，發現PFKM基因和6-PFK的含量極顯著高于其他組織。在生命活動中，PFKM基因的異常表達，也造成了葡萄糖的代謝過程的改變，尤其是增加了組織細胞的糖酵解速率，在一定水平上可以利用降低PFKM基因的表達及相關的酶活性的方法可以影響不同組織的發育水平，進而降低細胞的生長速度[15-17]。因此在PFKM基因和6-PFK在心臟組織中高度表達，其心臟在生命體能量代謝以及糖酵解途徑中，通過酶活性調節代謝的方式為機體提供能量，而磷酸果糖激酶活性的調控代謝可能在協同PFKM基因調控糖酵解代謝[18]。

采用熒光定量的方法分析PFKM基因在長白豬、梅山豬等豬肌肉部位中分布，PFKM基因在豬的心肌以及骨骼肌中具有較高的相對表達量，在卵巢、子宮、脂肪組織和腎臟表達程度中等，但在其肝臟、睪丸、脾臟和肺中表達量相對較低，在小腸和胃中沒有發現PFKM基因的表達。Wang Jun等[19]運用熒光定量PCR技術得出PFKM基因在豬不同部位的表達，尤其在心肌中，PFKM基因的表達量相對較高。與以上結果相似，PFKM基因在伊犁馬的心臟組織中表達顯著高于肝臟等其它組織。并且在伊犁馬的肝臟組織中PFKM基因的表達要顯著低于臀中肌、腹外斜肌、半腱肌、斜方肌、背闊肌、夾肌等組織。PFKM基因可能在伊犁馬的糖酵解過程中，通過心臟組織參與PFKM基因的重要調控機制。孫慧等[20]通過生物信息學網站，針對綜合質量評分最高的微小RNA進行進一步的檢測以及驗證，預測可能調控PFKM基因的微小RNA，并在PFKM基因的3’-UTR區域，推測出miR-141-3p可能是影響PFKM基因在不同組織中的的表達量進而改變生命細胞糖酵解的過程，控制其不同組織的發育水平。在轉基因小鼠的骨骼肌中發現PFKM基因在低表達時檢測到ATP能量水平很低、糖原含量高，致使小鼠的大部分組織的肌肉纖維改變甚至壞死，并且致使PFKM基因相關酶活性降低了大概50%左右，使紅細胞滲透脆性增大，結果表明6-磷酸葡萄糖在肌肉中的積累，與人類GSDVⅡ的肌病和代償性溶血特征具有相似性[21]。試驗中伊犁馬的PFKM基因在心臟組織中高表達，可能是伊犁馬具有強大的心肌纖維活力，在6-磷酸果糖激酶的作用下，調控PFKM基因的正常表達，更好的分解、利用ATP，為其生命活動提供能量。Gibb等[22]利用大鼠原代的心肌細胞作為試驗對象，并用雙CMV啟動子的磷酸酶缺陷型的病毒分別感染心肌，根據同位素示蹤法得到，在PFKM活性較高的細胞中可以間接的限制線粒體分解以及細胞呼吸作用來增強糖酵解活動。在糖酵解過程中，PFKM的表達與動物的心肌細胞反應密切相關，該基因可能對心肌細胞進行糖酵解有重要的影響。

4 結 論

PFKM基因在伊犁馬的不同組織中均有表達，且存在一定的差異性，其中心臟表達高達22.88。6-PFK的含量在伊犁馬不同組織的含量也存在顯著差異性，在心臟組織中的含量約為1.049 mg/L也顯著高于其他組織。PFKM基因和6-PFK可能在糖酵解過程中起著重要作用，PFKM基因可能通過影響6-PFK的酶活，對心臟組織進行糖酵解有重要影響，PFKM基因和6-PFK在馬匹的糖酵解過程中有重要的作用。

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