伊犁馬LPL基因多態性及其與肉質性狀關聯性分析

王建文，丁玉澤，李璐伶，姚新奎，曾亞琦，閆 睛，任萬路，王川坤，孟 軍

(1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運動生理重點實驗室/新疆農業大學馬產業研究院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】馬肉營養價值高[1]，肉馬養殖效益良好，馬匹繁育時代間隔長，選種準確性關系到馬匹培育質量，篩選LPL基因中與伊犁馬肉質性狀相關的突變位點，將研究結果與傳統選育方法相結合，有利于加快專門化肉用馬培育進程，對加快肉馬發展具有重要意義。【前人研究進展】脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase，LPL)屬于脂肪酶基因家族成員，主要由脂肪細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞合成與分泌，在甘油三酯及脂蛋白代謝和運輸中具有重要的作用[2]，廣泛分布于機體的肌肉和脂肪組織中[3]。LPL基因通過對甘油脂代謝、類固醇生物合成等信號通路調控，影響到脂肪的代謝與合成、沉積[4]。LPL基因在肉質及其胴體性狀選擇應用廣泛[5]。LPL基因表達較高的部位肌內脂肪含量將會有所上升[6]，對羊的研究結果也與此基本一致[7]，肉品的剪切力較小[8]，肉品的嫩度將得到改善[9]。LPL基因突變有利于肌內脂肪的沉積、肉品的嫩度及色澤的改善[10]，豬LPL基因的G117IC位點突變將使得其pH值顯著降低[11]，對于肌肉的成熟及其肉食用品質的提升有益。LPL基因的表達與其年齡及飼養條件有一定的關聯[12]，LPL基因的表達會對LPL酶活性產生影響，對肌內脂肪的水解代謝起到重要的調節作用[13]，通過對酶活性的調節，影響到肌內脂肪的沉積與代謝，使得肉的品質得到改善[14-15]。【本研究切入點】分子生物學方法已廣泛應用于其它家畜選種方面，但在專門化用途馬培育方面的研究相對較少。需研究伊犁馬脂蛋白脂酶基因多態性及其對肉質性狀的影響。【擬解決的關鍵問題】研究以伊犁馬為主要研究對象，測定LPL基因序列及其肉質性狀，研究伊犁馬LPL基因多態性及其與肉質性狀之間的關系，篩選與伊犁馬肉質性狀相關的LPL基因多態位點，為專門化肉用馬分子選育提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬 匹

選取41匹健康成年、伊犁馬為研究對象，馬匹膘情中等、無顯著親緣關系。馬匹由伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場提供。采用枸櫞酸鈉抗凝管采集頸靜脈血液樣本5 mL，混勻后置于-18℃冰箱待用。對所選馬匹禁食24 h、禁水12 h后屠宰，立即采集三角肌、背闊肌、臂三頭肌、腹外斜肌和臀中肌5個部位肌肉樣本，成熟24 h后置于-18℃保存待用。

1.1.2 引物設計與PCR擴增

參照GenBank中公布的純血馬LPL基因序列(登錄號：NC_009145.3)中第1外顯子、第3外顯子、第4外顯子和第10外顯子序列為目標片段，采用Primer軟件進行引物設計，所設計引物由上海生工根據設計引物序列進行引物合成。表1

1.2 方 法

1.2.1 PCR擴增與基因多態性檢測

本試驗采用降落PCR法進行擴增，具體程序為：95℃預變性3 min，94℃變性30s，63℃退火45s，每個循環降低0.5℃，72℃延伸1 min，共計10個循環；而后94℃變性30s，退火45s，72℃延伸1 min，共計30個循環，72℃修復延伸10 min。PCR擴增產物用1.5% TAE瓊脂糖電泳進行檢測。表2

表1 LPL基因引物基本信息

1.2.2 肉質性狀檢測

對所采集的肉樣在4℃環境中排酸24 h后測定肉質性狀。在4 000 r/min條件下離心20 min，測定肉樣系水力；在水浴鍋中將肉樣隔袋水煮30 min測定肉樣熟肉率；將煮熟的肉樣沿肌纖維方向修整為橫截面積為1 cm2的長條，采用物性儀測定肉樣剪切力，每個樣本重復測定10次，取最接近3次測定樣本平均值為該肉樣的剪切力。

1.3 數據處理

將符合條件的PCR擴增產物送至上海生工采用雙向測序法進行測序，檢測結果采用DNAStar軟件校正，并與純血馬LPL基因序列(登錄號：NC_009145.3)比對，采用BLAST確定突變位點及基因型。

采用HaploView 4.2軟件對基因數據分析群體遺傳學，運用Excel軟件整理肉質性狀，根據基因型進行分組，采用SPSS 18.0軟件對肉質性狀數據進行獨立樣本T檢驗，結果以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 LPC基因引物PCR擴增

研究表明，各電泳條帶清晰明亮，且無拖尾與雜帶現象發生。第1泳道為第3外顯子擴增產物，擴增片段長度約785 bp，第2泳道為第1外顯子擴增產物，擴增片段長度約664 bp，第3泳道為第10外顯子擴增產物，擴增片段長度約515 bp，第4泳道為第4外顯子擴增片段，擴增片段長度約621 bp，各擴增片段長度均與目的片段長度相一致。圖1

注：第1泳道為第3外顯子，第2泳道為第1外顯子，第3泳道為第10外顯子，第4泳道為第4外顯子

2.2 LPC基因測序同譜對比

研究表明，共計檢測出2個SNP位點，其中第1個SNP位點位于第1外顯子和第2外顯子中間的內含子區域：g.715T>C，共檢測出2種基因型(TT基因型和TC基因想)；另一個SNP位點位于第4外顯子和第5外顯子中間的內含子區域：g.12074C>A，共檢測出2種基因型(CC基因型和AC基因型)。圖2

圖2 LPL基因測序圖譜

2.3 伊犁馬LPL基因多態位點遺傳學

研究表明，g.715T>C突變位點的優勢基因型為TT基因型，優勢等位基因為T；g.12074C>A突變位點的優勢基因型為CC基因型，優勢等位基因為C；χ2所檢測出的兩個位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05)。所檢測出的2個突變位點均為低度多態位點(PIC<0.25)。表3，表4

表3 LPL基因不同突變位點基因型及基因頻率

表4 LPL基因不同突變位點遺傳學特性

2.4 伊犁馬LPL基因不同基因型對肉質性狀的影響

研究表明，g.715T>C突變位點而言，在三角肌中TT基因型剪切力顯著高于TC基因型(P<0.05)；在背闊肌中TT基因型失水率顯著高于TC基因型(P<0.05)，剪切力極顯著高于TC基因型(P<0.01)；在臂三頭肌中TT基因型失水率極顯著低于TC基因型(P<0.01)；在腹外斜肌中TT基因型剪切力極顯著低于TC基因型(P<0.01)；在臀中肌中TT基因型失水率和剪切力顯著高于TC基因型(P<0.05)。g.12074C>A突變位點，在三角肌中CC基因型熟肉率顯著高于CA基因型(P<0.05)；在背闊肌中CC基因型失水率顯著低于CA基因型(P<0.05)；在臂三頭肌中CC基因型失水率極顯著低于CA基因型(P<0.01)，熟肉率和剪切力極顯著高于CA基因型(P<0.01)；在腹外斜肌中基因型剪切力極顯著高于CA基因型(P<0.01)，失水率和熟肉率顯著低于CA基因型(P<0.05)；在臀中肌中失水率CC基因型極顯著低于CA基因型(P<0.01)。表5

表5 伊犁馬LPL基因多態性與肉質性狀關聯

3 討 論

LPL基因在機體內各主要器官、組織中均有表達，在各種脂類代謝中起著重要作用[16]，LPL基因突變將導致其編碼的蛋白活性發生變化，從而影響到其結構與功能，對動物肉品質產生影響[17]。馬LPL基因位于2號染色體，編碼471個氨基酸，共有10個外顯子[18]，試驗對伊犁馬的4個外顯子及其附近內含子區域進行多態性檢測，共檢測出2個內含子突變。大約每644～891 bp就會出現一個突變位點[19]，所檢測出突變的擴增產物片段大小與此基本一致，通過比對序列顯示，2個突變均為該基因突變位點。所檢測出的2個突變位點均為內含子突變，且為新發現突變位點，可能是由于該基因在馬匹方面的研究較少，暫時未能發現該突變位點；可能是由于品種因素的影響[20]，伊犁馬為我國自主培育品種，在其培育過程中曾引入部分品種對其進行改良，也可能是其出現新突變位點的因素之一[21]。χ2檢驗結果顯示，這兩個突變位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態，該群體基因型頻率和基因頻率具有較好的穩定性，遺傳變異度相對較小，在后期人工定向選擇時具有較大的潛力[22]。

研究將檢測出的2個突變位點與伊犁馬肉質性狀進行關聯性分析，研究結果顯示g.715T>C和g.12074C>A突變位點在臂三頭肌、背闊肌和臀中肌中兩種基因型之間失水率均呈現出顯著差異性，相關研究結果顯示，失水率越低則肉質越好[23,24]，這2個突變位點對伊犁馬肉品質產生一定影響，在選育的過程中可以加以利用；但在三角肌中差異不顯著，可能是由于試驗中所選擇的樣本量相對較小所致，還需要加大樣本量進行證實。熟肉率是肉品加工過程中的重要評價指標之一，熟肉率高則表明在加工過程中其失水較少，肉品的多汁性較好[2]，g.12074C>A突變位點三角肌和臂三頭肌中CC基因型熟肉率較高，顯示出該突變位點CC基因型肉品加工效率較好，在選育的過程中可以考慮以該基因型為主。g.715T>C位點背闊肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異，三角肌、臀中肌中剪切力呈顯著差異；g.12074C>A臂三頭肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異，造成這種現象的原因可能是由于這兩個突變位點雖然位于內含子區域，不會對蛋白質中氨基酸產生影響，但可能參與到該基因的表達調控或與其相關的功能基因一起產生影響，影響到該基因的表達，影響到該蛋白質的生理活性，導致其剪切力產生了一定的差異，但具體的原因還有待于進一步的機理性研究加以證實。對牛的研究結果顯示，LPL基因表達量較高的部位其肌內脂肪含量會有所上升[25]，此時該部位肉品的剪切力會有所下降[26]，使得肉品的嫩度得到改善[27]，對羊的研究結果也可得到與此類似的結論[28]。g.12074C>A突變位點臂三頭肌和腹外斜肌中CC基因型極顯著高于CA基因型，該突變位點對伊犁馬肉的嫩度會產生較大的影響，在對肉用馬的選育過程中。研究中所檢測出突變位點未能在部分部位中對所檢測指標產生影響，可能是由于部位因素的影響，也可能是因為所檢測樣本量較少所致，在今后的研究中可加大樣本量進一步加以驗證。

4 結 論

在伊犁馬LPL基因中共檢測出g.715T>C和g.12074C>A兩個突變位點，均為低度多態位點且為Hardy-Weinberg平衡狀態。g.715T>C位點兩種基因型臂三頭肌失水率呈極顯著差異，背闊肌、臀中肌失水率呈顯著差異；背闊肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異，三角肌、臀中肌中剪切力呈顯著差異。g.12074C>A位點兩種基因型臂三頭肌、臀中肌中失水率呈極顯著差異，背闊肌、腹外斜肌中失水率呈顯著差異；臂三頭肌中熟肉率呈極顯著差異，三角肌、腹外斜肌中熟肉率呈顯著差異；臂三頭肌、腹外斜肌中剪切力呈極顯著差異。2個突變位點對伊犁馬肉質會產生一定影響，是影響伊犁馬肉質性狀的可能候選功能基因位點。

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