煙草兩種質源胞質雄性不育系生化特性比較

彭堅強，陳學軍，吳興富*，焦芳嬋，馮智宇，楊大海，張誼寒，劉天彥，楊林明

(1 云南省煙草農業科學研究院，云南 昆明 650021； 2 云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000；3 云南省煙草公司曲靖市公司，云南 曲靖 655000)

煙草是重要的經濟作物，利用雄性不育系配制雜交種已得到廣泛應用，不育系雜交種種植面積占全國煙草面積的50%以上[1]。我國煙葉主產區主栽品種所用的不育系胞質，均來源于野生種Nicotianasuaveolen(以(sua)S表示，下同)。近年來，通過細胞融合并輔助以流式細胞術篩選等手段，獲得了源自N.glauca(以(gla)S表示，下同)等材料的不育胞質[2-4]。不同來源的煙草不育胞質，其配合力、敗育特點及胞質效應不同。開展煙草不同來源胞質雄性不育系生化特性的機理研究，對不同來源胞質雄性不育系雜交種的應用尤為重要。煙草細胞質雄性不育系(CMS)是煙草遺傳育種的重要材料，對不育機理的研究主要集中在細胞膜系統和能量代謝關鍵酶活性的比較方面。細胞膜對細胞具有保護作用，當細胞膜受到損傷或破壞時，細胞的生物學功能將受到影響甚至喪失[5]。前人研究認為，超氧化物歧化酶(SOD)的主要功能是清除生物體內的超氧離子基團，使生物體內過多的氧轉變成為H2O2，過氧化物酶(POD)能清除植物體內產生的有毒H2O2。作為生物體內主要的活性氧防御酶，SOD和POD協同維持體內的活性氧代謝平衡，保護生物膜結構[6-7]。

關于(gla)S與(sua)S兩種來源的不育系與其保持系，其主要生育期葉片中POD及SOD酶活性變化特點，以及盛花期葉片及花蕾POD、SOD酶活性、ATP含量等鮮有報道。本文研究了(gla)S、(sua)S及其保持系MF K326主要生育期POD酶和SOD酶活性和盛花期POD酶、SOD酶活性以及ATP和ADP含量，為進一步探討煙草胞質不育系機理，多途徑挖掘和創制雄性不育新胞質源及在育種上的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Nta(gla)S K326(以(gla)S表示，下同)胞質是經體細胞雜交并以K326為父本回交10代獲得的不育系胞質[3]，Nta(sua)S K326胞質(以(sua)S表示，下同)和保持系K326(以MF K326表示，下同)由中國煙草育種研究(南方)中心提供。

1.2 取樣方法

在煙株成苗期、團棵期、旺長期、現蕾期及盛花期取供試材料中部葉片進行POD活性及SOD活性的測定。在盛花期，取花蕾及中部葉片進行POD、SOD活性及ATP、ADP含量測定。

1.3 POD及SOD活性測定

用索萊寶公司的檢測試劑盒測定POD及SOD的活性，測定方法分別為愈創木酚法和黃嘌呤氧化酶法。

1.4 ATP及ADP含量測定

稱取2 g樣品迅速放入液氮中研磨成粉末，盡量研磨細一點。加入10 mL 0.6 mol/L的HClO4到磨細的樣品中，混勻后置于冰上1 min。將上述混合液在4 ℃，6 000×g離心10 min。吸取上清液(約6 mL)，用1 mol/L的KOH中和其pH至6.5～6.8，上清液置于冰上30 min，以將形成的高氯酸鉀沉淀下來。用濾紙將沉淀物過濾掉，然后再用0.25 μm的濾膜過濾1次。 此步驟可選擇在4 ℃，6 000×g離心5 min代替。最終得到約8 mL的過濾液(離心液)，將其貯存在-30 ℃用于測定分析[8]。

1.5 數據處理

采用DPS方差分析軟件和Excel進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 兩種質源胞質不育系及保持系主要生育期POD及SOD活性

測定結果表明(表1)，在煙葉主要生育期，供試材料SOD活性呈先增強后降低趨勢，團棵期活性最強。數據分析表明，成苗期、團棵期供試材料3者間無顯著差異；旺長期、現蕾期、盛花期(gla)S、(sua)S與MF K326存在顯著差異。POD活性呈現升—降—升的趨勢，煙株團棵期活性最強。數據分析表明，成苗期(gla)S同MF K326無顯著差異，(sua)S同MF K326存在顯著差異；團棵期、旺長期、現蕾期(gla)S、(sua)S與MF K326存在顯著差異，(gla)S與(sua)S間也存在顯著差異；盛花期(gla)S、(sua)S與MF K326存在顯著差異。

表1 兩種質源胞質不育系及保持系主要生育期POD及SOD活性

2.2 盛花期葉片及花蕾ATP、ADP含量及POD、SOD活性

2.2.1 ATP及ADP含量

由圖1可知，花蕾組織中，(gla)S的ATP+ADP總量僅比MF K326的減少2.86%，而(sua)S的ATP+ADP總量比MF K326的減少20.86%。葉片組織中，(gla)S的ATP+ADP總量比MF K326的減少35.03%，而(sua)S的ATP+ADP總量比MF K326的減少74.52%。花蕾組織中，MF K326的ATP含量是其ADP的2.02倍，(gla)S的ATP含量是其ADP含量的1.19倍，(sua)S的為1.39倍。葉片組織中，MF K326的ATP含量是其ADP的1.72倍，(gla)S的ATP含量是其ADP含量的1.27倍，(sua)S的為1.56倍。盛花期(gla)S的葉片及花蕾組織中，其ATP及ADP含量均高于(sua)S不育系胞質。

圖1 兩種質源不育系胞質及其保持系花蕾與葉片中ATP及ADP含量Fig.1 ATP and ADP measurements in leaf and floral buds from (gla)S，(sua)S and MF K326

2.2.2 POD及SOD活性比較

由圖2可知，盛花期葉片樣品的MF K326的POD活性顯著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S間無顯著差異；花蕾中，MF K326的POD活性顯著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S間無顯著差異。

圖2 盛花期POD活性比較Fig.2 Enzyme enzyme activity of SOD at the flowering stage

SOD酶活性測定結果表明(圖3)，盛花期葉片樣品的SOD活性MF K326、(gla)S、(sua)S三者無顯著差異；花蕾中MF K326的SOD活性顯著高于(gla)S和(sua)S，(gla)S和(sua)S無顯著差異。

圖3 盛花期SOD活性比較Fig.3 Enzyme enzyme activity of SOD at the flowering stage

3 討論

ATP是促進植物細胞內各物質合成的直接能源，ATP含量降低，植物體內各種生物大分子合成會受阻或減少。玉米、高粱、水稻等作物中報道，ATP含量在不育系中顯著的降低。Bergman[9]研究了煙草Nta(rep)S不育系與其保持系花蕾組織ATP與ADP的含量，發現不育系的ATP與ADP的含量顯著低于保持系。本研究對兩種質源不育系盛花期的葉片與花蕾ATP與ADP含量測定結果表明，保持系葉片及花蕾的ATP含量顯著高于供試的兩種不育系胞質，說明在供試兩種不育系的花器官生長發育過程中由于ATP含量下降，可能會使煙株體內生物大分子合成受阻或減少，這也可能是導致供試兩種不育系花粉敗育的一個原因。

POD是一種具有多種生理功能的酶，可以氧化自由基吲哚乙酸和催化多種反應等。發育正常的植株，其體內POD酶活性維持一定水平以去除活性氧，使植物體內的POD與活性氧維持一定的平衡[10]。SOD能夠清除植物體內的超氧自由基，是植物重要的抗氧化物保護酶。本研究對主要生育期葉片POD和SOD酶活性測定表明，MF K326與(gla)S、(sua)S的POD及SOD酶活性均在團棵期達到最高值；在全生育期，MF K326的POD及SOD酶活性也均高于兩種不育胞質。盛花期葉片與花蕾組織中POD及SOD酶活性測定結果表明，葉片及花蕾組織MF K326的POD及SOD酶活性也高于(gla)S及(sua)S不育胞質。本研究表明，供試兩種不育胞質POD酶活性降低，可能會使煙株體內的POD與活性氧失去平衡，而SOD酶活性的降低可能會使植物體內產生的超氧自由基不能及時清除，酶活性的改變可能會引起膜質不穩定從而出現不育。這在煙草(sua)S不育系花蕾[11-12]、小麥[5]、水稻[13]、玉米[14]等作物不育系研究中均有報道。另外，本研究對(gla)S和(sua)S花柱比較發現，(gla)S的花柱和保持系一樣，柱頭為兩瓣，而(sua)S則以3瓣和4瓣為主，花柱有畸形等。這種現象是否與(gla)S胞質較高的ATP含量、SOD酶活性高于(sua)S等有關，尚待下一步開展基于基因組學、代謝組學為基礎的相關研究予以闡明。

4 結論

煙草兩種質源胞質雄性不育系同保持系之間在盛花期POD、SOD酶活性及ATP、ADP含量發生明顯變化，MF K326的POD及SOD酶活性均顯著高于(gla)S及(sua)S，ATP、ADP含量顯著高于(gla)S及(sua)S。盛花期是種子形成的關鍵時期，酶活性的降低和ATP、ADP含量下降是導致(gla)S及(sua)S不育的重要因素。本研究為進一步開展胞質不育系機理研究及雜種優勢利用提供了基礎。