磷霉素對萬古霉素致腎損傷模型大鼠Keap1-Nrf2/ARE通路的影響*

黃曉青，黃麗蓓，楊斌，林子杰，梁雪，何慶林，丘岳

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部，南寧 530021；2.廣西醫科大學藥學院，南寧 530021；3.廣西醫科大學第一臨床醫學院，南寧 530021)

萬古霉素是治療耐藥革蘭陽性菌，特別是金黃色葡萄球菌感染的一線藥物。萬古霉素主要經腎消除，給藥劑量90%在給藥24 h內從尿排出。萬古霉素腎損傷(vancomycin-induced kidney injury，VIKI)是限制其臨床應用的原因之一，萬古霉素的腎毒性在給藥后4～8 d即可出現，表現為血清肌酐水平升高、腎小球濾過率降低等，其機制尚未完全清楚[1]。磷霉素作用于細菌細胞壁合成的早期，可破壞細菌外層結構或改變聯用藥物進入菌體途徑，使藥物在菌體內易于富集而出現良好的協同作用，可與多種抗菌藥物聯合使用[2]。萬古霉素聯合磷霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及其引起的慢性生物被膜感染有協同殺菌作用。磷霉素聯合萬古霉素為臨床治療MRSA感染特別是萬古霉素血藥濃度較低部位如顱內感染以及感染性心內膜炎等常用聯合方案之一[3-4]。研究報道，磷霉素對萬古霉素、氨基糖苷類、順鉑等藥物引起的腎功能損傷有保護作用，機制尚未明確[4]。本課題組前期研究發現，磷霉素能有效改善萬古霉素所致大鼠腎損傷，其機制可能與抑制大鼠體內的氧化應激反應有關[5]。Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch like epichlorohydrin related protein-1，Keap1)-核因子E2相關因子(nuclear factor E2 related factor，Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant responsive element，ARE)(Keap1-Nrf2/ARE) 信號通路是機體內最重要的內源性抗氧化信號通路[6]，故本研究從Keap1-Nrf2/ARE氧化應激信號通路及下游靶蛋白谷胱甘肽過氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1，GPX-1)探討VIKI及磷霉素保護機制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 注射用鹽酸萬古霉素(浙江醫藥新昌制藥廠，批號：1161191108)；注射用磷霉素鈉(東北制藥集團沈陽第一制藥廠，批號：H2018-3433)；總蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20191022)；尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司，批號：201912)；腎損傷因子1(kidney injury molecule 1，KIM-1)試劑盒(Elabscience，批號XQG7W9KIS)；RNA提取試劑盒(美國Axygen公司，批號03712KD6)；逆轉錄試劑(Takara公司，批號 RR028A-1)；熒光染料SYBR Green (Throme公司，批號 00751233)；Nrf2、Keap1、GPX-1及β-Action 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2實驗動物 成年健康清潔級雄性SD大鼠，60只，體質量180～220 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(桂)2019-0035。大鼠飼養于溫度為(26±1)℃、相對濕度為85%、清潔級動物實驗室內，自由飲水進食，實驗前適應性喂養3 d。

1.3儀器 ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國伯樂生命醫學產品有限公司，Bio-Rad CFX Touch)；臺式高速冷凍離心機(艾本德中國有限公司，5810R)；連續光譜掃描式酶標儀(美國Molecular Devices公司，SpectraMaxPlus384)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司，CKX-41)。

1.4動物分組與給藥 雄性SD大鼠60只，按照隨機數字表法分為正常對照組、磷霉素組、模型對照組(萬古霉素組)和聯合用藥小、中、大劑量組(記為聯合-L組、聯合-M組、聯合-H組 )，每組各10只。正常對照組大鼠給予等劑量 0.9%氯化鈉注射液，模型對照組大鼠給予萬古霉素0.2 g·kg-1，磷霉素組給予磷霉素0.25 g·kg-1，聯合-L組、聯合-M組、聯合-H 組分別給予磷霉素0.125，0.25，0.5 g·kg-1，30 min后給予萬古霉素0.2 g·kg-1，均腹腔注射，每天 1次，連續21 d。給藥劑量依據：萬古霉素腎功能正常成人劑量一般2～4 g·d-1，兒童為0.06 g·kg-1·d-1。根據課題組前期研究，萬古霉素0.2 g·kg-1可成功造模[5]。磷霉素成人用量為4～12 g·d-1，嚴重感染可增加至12 g·d-1，兒童劑量為0.1～0.3 g·kg·d-1，因此聯合給藥組磷霉素設置了3個濃度。

1.5尿液KIM-1、24 h尿蛋白、NAG含量測定 給藥最后一天收集大鼠24 h尿液，常溫下3 000 r·min-1(r=10.9 cm)離心尿液10 min，上清液置于-80 ℃冰箱保存，測定尿中KIM-1、24 h尿蛋白、尿NAG。其中，KIM-1、NAG均采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法測定；24 h尿蛋白采用考馬斯亮藍法測定；實驗操作按照相關試劑盒說明書進行。

1.6實時熒光定量PCR 檢測腎組織Nrf2、Keap1、GPX-1 mRNA 表達 根據試劑盒步驟，提取腎組織RNA，再逆轉錄為cDNA，采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行擴增。以β-Action作為內參。β-Action的引物序列上游：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游5′-CCACAGGATTCCATACCCAA-3′。Nrf2的引物序列上游：5′-TGCCCCTGTGGTCAAAGTG-3′，下游5′-GGTTCGGTTACCGTCCTGC-3′。KEAP1的引物序列上游：5′-GAGATATGAGCCAGATCGAGACG-3′，下游5′-GGTGTAATCATCCGCCACTCAT-3′。GPX-1的引物序列上游：5′-GTCCACCGTGTATGCCTTCTC-3′，下游：5′-CAGCAGGGCTTCTATATCGGG-3′。用Relative Quanti-fication Study分析方法進行分析，用2-△△Ct法對PCR結果數據進行計算。

2 結果

2.1各組大鼠尿液KIM-1、24 h尿蛋白、NAG測定結果 與正常對照組大鼠比較，模型對照組24 h尿蛋白、NAG、KIM-1水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，聯合-M、聯合-H組24 h尿蛋白、NAG、KIM-1含量下降明顯(P<0.01)，且與磷霉素呈劑量依賴性，見表1。

表1 6組大鼠尿液KIM-1、24 h尿蛋白、NAG測定結果

2.2各組大鼠腎組織Nrf2、Keap1、GPX-1 mRNA表達情況 與正常對照組大鼠比較，模型對照組腎臟組織Nrf2 mRNA表達升高(P<0.01)，GPX-1 mRNA表達下降，keap1幾乎無變化，提示模型對照組已經在萬古霉素誘導下發生了氧化應激反應。聯合-L及聯合-M 組Nrf2、Keap1 mRNA表達明顯升高(P<0.01)，聯合給藥3個劑量組GPX-1 mRNA 表達均顯著升高(P<0.01)，提示磷霉素能激活GPX-1 mRNA表達。見表2。

表2 6組大鼠Nrf2、Keap1和GPX-1 mRNA表達情況

3 討論

VIKI的產生機制尚不完全清楚，可能包括[7]①免疫反應：VIKI是由包括酸性粒細胞、肥大細胞、漿細胞、淋巴細胞和巨噬細胞在內的間質浸潤對萬古霉素的免疫應答。②急性腎小管壞死：a.氧化應激，近曲小管細胞的氧化應激是引起急性腎小管壞死最常見的機制。萬古霉素通過增加耗氧及三磷酸腺苷(ATP)濃度來刺激氧化磷酸化，形成鐵絡合物產生自由基。自由基誘導脂質過氧化，導致線粒體膜去極化，釋放細胞色素C，激活半胱天冬酶，導致細胞凋亡[8]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)是一種氧化應激蛋白，可催化血紅素生成膽綠素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和鐵離子，在氧化性腎損傷中發揮重大的保護作用。HMOX1可降低組織對氧化應激的敏感程度，Nrf2是其主要的上游調控基因之一。b.管型形成[9]，多種因素可導致萬古霉素在腎小管內過飽和和沉淀，包括藥物濃度過高和低尿pH值。萬古霉素能誘導腎小管上皮細胞耗氧量升高，介導氧化應激的產生，生成大量活性氧，導致氧化還原平衡失調，造成腎小管損傷[6，10-11]。

實驗選用雄性 SD 大鼠，原因在于雌鼠的雌激素含量相對較高，而雌激素具有顯著的抗炎作用，可能會影響實驗結果[12]。尿NAG是一種溶酶體水解酶，在腎小管上皮細胞中的含量相對較高，其含量水平能迅速反映腎小管實質細胞的損傷情況，也可反映腎功能早期損傷情況。KIM-1是一種跨膜糖蛋白，主要由腎近曲小管上皮細胞產生，正常情況下表達較少或基本不表達(健康人群尿液中檢測不到)，當缺氧或損傷時可刺激近端腎小管大量表達，尿KIM-1明顯增加[13-14]。血清尿素氮、肌酐為腎損傷的傳統指標，而尿 KIM-1及NAG的靈敏度、特異性高，可作為一種快速反映早期腎損傷的生物標志物[15]。與正常對照組大鼠比較，模型對照組尿液24 h尿蛋白、NAG、KIM-1含量顯著升高，聯合-M、聯合-H組24 h尿蛋白、NAG、 KIM-1含量下降。從聯合-M、聯合-H組的總體趨勢看，磷霉素對萬古霉素腎損傷的保護作用表現出劑量依賴性。

Keap1-Nrf2/ARE是近年來新發現的機體抵抗外界氧化刺激的防御性轉導通路[16]。Nrf2是一種重要內源性保護因子，可控制外周淋巴系統，維護及穩定內環境，間接發揮抗氧化作用，調節有關促炎癥反應的刺激因素，保護相關細胞與組織，并且在病理性炎癥反應中起到保護作用。通常情況下，Nrf2 在細胞質中并不單獨存在，而是與細胞骨架相關蛋白 Keap1 以二聚體形式結合存在。外界氧化應激因子刺激后，Nrf2與Keap1解離，轉位進入細胞核，通過 Keap1-Nrf2/ARE 信號通路調節抗氧化酶基因，并誘導下游靶蛋白 GPX-1表達，激活氧化應激系統，啟動抗氧化作用，從而保護組織和細胞[17-18]。故本研究以Keap1-Nrf2/ARE信號通路為主，探討Nrf2、Keap1及下游蛋白 GPX-1 mRNA表達情況。

與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎臟組織Nrf2 mRNA表達升高，Keap1幾乎無變化，GPX-1 mRNA表達下降，提示模型對照組在萬古霉素誘導下發生了氧化應激反應，但并未激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路。采用磷霉素干預后聯合用藥組Nrf2、Keap1及GPX-1 mRNA表達均顯著升高，明顯高于正常對照組及模型對照組，提示磷霉素通過促進 Nrf2與 Keap1 解離，使其進入細胞核內，結合ARE，誘導下游靶蛋白 GPX-1 表達，進而增強機體抗氧化反應能力。

綜上所述，磷霉素通過刺激GPX-1 mRNA的表達改善萬古霉素引起的腎損傷，其機制可能是激活機體抵抗外界氧化刺激的防御性轉導Keap1-Nrf2/ARE信號通路。

本研究不足之處是技術手段較單一，研究內容不夠豐富，擬在下一步研究中采用蛋白質免疫印跡實驗加以驗證，并進一步研究VIKI的產生機制及磷霉素的保護作用。