基于多指標(biāo)響應(yīng)面法優(yōu)化土炒當(dāng)歸炮制工藝*

楊柳，李永強(qiáng)，張芮萌，張馨月，鞠春梅，李艷杰

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 130117；2.延吉市醫(yī)院消化內(nèi)科，延吉 133000)

當(dāng)歸性溫，味甘、辛，系傘形科多年生草本植物，以干燥根入藥[1]，具有補(bǔ)血、活血、止痛、潤腸的功效[2-3]。以甘肅省岷縣為主產(chǎn)地。陜西、四川、湖北、云南等省均有栽培，秋季采挖。《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為中品[4]。當(dāng)歸的炮制古代就十分被重視，文獻(xiàn)記載較多。《劉涓子鬼遺方》有炒當(dāng)歸的記載，其后歷代文獻(xiàn)提及炮制方法有25種之多[5]。其中，生當(dāng)歸、酒浸炒當(dāng)歸、土拌炒當(dāng)歸、油拌炒當(dāng)歸與當(dāng)歸炭等炮制品在臨床上應(yīng)用廣泛[6-8]。炮制的目的在于改變藥性，擴(kuò)大藥用范圍[9]。傳統(tǒng)的炮制理論認(rèn)為“土炒入脾”，當(dāng)歸土炒能增強(qiáng)入脾補(bǔ)血作用。臨床常用復(fù)方制劑如補(bǔ)脾益腸丸、草仙乙肝膠囊等是以土炒當(dāng)歸用藥，然而《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)(2020年版)以及《吉林省地方炮制規(guī)范》(1986年版)并未收錄土炒當(dāng)歸的炮制工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[10]；雖然《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)規(guī)定土炒當(dāng)歸制法為“取當(dāng)歸片，用伏龍肝細(xì)粉炒至表面掛土色，篩去多余土粉，取出放涼”[11]，《湖北省中藥飲片炮制規(guī)范》(2018年版)規(guī)定土炒當(dāng)歸制法為“取凈當(dāng)歸片，照土炒法炒至表面掛土色”[12]，但均過于籠統(tǒng)，并未見具體的炮制工藝技術(shù)參數(shù)。因此對于吉林省中藥生產(chǎn)企業(yè)而言，土炒當(dāng)歸尚無明確標(biāo)準(zhǔn)可依。

通過文獻(xiàn)研究及飲片生產(chǎn)企業(yè)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，在土炒工藝中灶心土用量會影響其炒制品質(zhì)量，灶心土與當(dāng)歸應(yīng)混勻且覆蓋充分，使炒制均勻；炒制溫度過高、炒制時間過長飲片容易焦化而藥效降低，相反飲片炒制火候不足，影響整體效果。綜上，灶心土用量、炒制溫度和炒制時間等因素相互影響。因此筆者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面法，將評價飲片質(zhì)量的外觀性狀與阿魏酸及揮發(fā)油等化學(xué)成分含量的客觀指標(biāo)相結(jié)合，多指標(biāo)、綜合評價各實(shí)驗(yàn)因素的主效應(yīng)，優(yōu)選出土炒當(dāng)歸炮制工藝參數(shù)。通過對當(dāng)歸土炒工藝開展深入研究，實(shí)現(xiàn)炮制工藝的規(guī)范化，以期為土炒當(dāng)歸在藥食領(lǐng)域的開發(fā)與工業(yè)化大生產(chǎn)提供理論依據(jù)與實(shí)踐參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2030型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，JT2001型分析天平(上海佑科儀表有限公司，感量：0.01 mg)，SK1200B型超聲波清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器公司)，MS-5型多功能電熱炒貨機(jī)(常州市金壇邁斯機(jī)械有限公司)，AR-688型紅外線測溫儀(蘇州市希瑪儀表有限公司)，SHB-Ⅲ型臺式循環(huán)水式真空泵(上海力辰儀器科技有限公司)等。

1.2藥品與試劑 當(dāng)歸飲片購自長春宏檢大藥房，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王哲副教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的根，并依據(jù)《中國藥典》(2020年版)一部當(dāng)歸飲片項(xiàng)下檢測，符合相關(guān)規(guī)定；灶心土(批號：200401)購自安國市安興中藥飲片公司；阿魏酸對照品(批號：111730-201915，含量：99.4%)和當(dāng)歸對照藥材(批號：121054-201308)均購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸、乙腈、甲醇均為國產(chǎn)色譜純，購自山東禹王和天下新材料有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1土炒當(dāng)歸樣品制備 取當(dāng)歸飲片200 g，按照設(shè)計(jì)的工藝條件，用電熱炒貨機(jī)炒制，紅外線測溫儀測定鍋體溫度，平行制備所需樣品。具體操作方法為：將灶心土細(xì)粉適量，置鍋內(nèi)，以文火將土炒至松散，加入當(dāng)歸飲片，相應(yīng)溫度的文火炒制，取出，將多余土粉篩去，晾涼，即得。

2.2土炒當(dāng)歸質(zhì)量評分規(guī)則 外觀性狀是判斷炮制品是否符合傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)指標(biāo)的基礎(chǔ)，但《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)僅以土炒當(dāng)歸飲片的外觀性狀來判斷其炮制程度，不夠客觀。參考《中國藥典》(2020年版)將揮發(fā)油和阿魏酸作為評價當(dāng)歸飲片質(zhì)量的指標(biāo)性成分，其作用與當(dāng)歸主要功效一致：當(dāng)歸中有機(jī)酸類活性成分阿魏酸，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、保肝利膽、抗氧化等作用[13]；當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分藁本內(nèi)酯和正丁烯基苯酞具有緩解氣管和腸平滑肌痙攣、抑制血小板聚集作用[14]。因此，本研究擬以外觀性狀、阿魏酸與揮發(fā)油含量作為評價土炒當(dāng)歸炮制程度的質(zhì)控指標(biāo)。

2.2.1外觀性狀評分規(guī)則 結(jié)合《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)對土炒當(dāng)歸炮制程度的要求，以及通過飲片生產(chǎn)企業(yè)調(diào)研，本實(shí)驗(yàn)擬對土炒當(dāng)歸從表面、斷面顏色及氣味等方面進(jìn)行評分。每項(xiàng)根據(jù)炒制情況給予1～5分，將以上三項(xiàng)評分求和即為外觀性狀得分，以評分高者為佳。土炒后的當(dāng)歸表面呈棕黃色，并均勻掛土，斷面為土黃色，具有當(dāng)歸固有香味及土香氣者為最優(yōu)，記為15分。具體得分規(guī)則見表1。

表1 土炒當(dāng)歸外觀性狀得分規(guī)則

2.2.2綜合得分評價指標(biāo) 為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果全面反映土炒當(dāng)歸質(zhì)量，本研究對外觀性狀分值與含量測定分值各賦予了相應(yīng)的權(quán)重。設(shè)定加權(quán)綜合評分滿分100分，外觀性狀、阿魏酸含量及揮發(fā)油含量權(quán)重系數(shù)分別為30%，35%，35%，以質(zhì)量控制指標(biāo)所在組中最高值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，公式為Y=(Y1/Y1max)×30+(Y2/Y2max)×35+(Y3/Y3max)×35。其中，Y為加權(quán)綜合評分值；Y1～Y3分別為某批次土炒當(dāng)歸外觀性狀、阿魏酸含量及揮發(fā)油含量；Y1max～Y3max分別為其外觀性狀、阿魏酸含量及揮發(fā)油含量的最高值。

2.3阿魏酸含量測定

2.3.1陰性對照品溶液的制備 以70%甲醇作為陰性對照品溶液。

2.3.2對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品適量，使用70%甲醇溶解于棕色量瓶中，配制成12.3 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3.3供試品溶液的制備 精密稱取土炒當(dāng)歸粉末(過篩孔內(nèi)徑0.355 mm藥篩)約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，移取70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，并加熱回流30 min。放冷后，以70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，將上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4色譜條件 色譜柱：Shimadzu InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.085%磷酸溶液(17：83)；檢測波長316 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速為1.0 mL·min-1；理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)應(yīng)不少于5000。陰性對照品、阿魏酸對照品及土炒當(dāng)歸供試品高效液相色譜圖見圖1。

圖1 陰性對照品、阿魏酸對照品和供試品的高效液相色譜圖

2.3.5線性關(guān)系考察 精密移取12.3 μg·mL-1阿魏酸對照品溶液，加入70%甲醇稀釋成1.23，2.46，4.92，7.38，9.84，12.30 μg·mL-1溶液。按照“2.3.4”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀測定，并記錄峰面積。將對照品溶液濃度(X，μg·mL-1)設(shè)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)設(shè)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=45 011.76X-2 763.83(r=0.999 9)。結(jié)果顯示，阿魏酸濃度在1.23～12.30 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積之間的線性關(guān)系良好。

2.3.6方法學(xué)考察 按“2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，所得阿魏酸峰面積RSD為0.39%，表明儀器有良好的精密度；取同一批土炒當(dāng)歸粉末，制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測得阿魏酸峰面積RSD為1.35%，表明該方法重復(fù)性良好；取同一供試品溶液，于0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算得阿魏酸峰面積RSD為1.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；精密稱取已知含量的土炒當(dāng)歸粉末(阿魏酸含量為0.51 mg·g-1)約0.1 g，共6份，分別倒入錐形瓶中，各精密加入阿魏酸對照品溶液(濃度為12.3 μg·mL-1)4 mL，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并注入高效液相色譜儀，依法測定，計(jì)算得平均加樣回收率為101.302，RSD 1.99%，符合《中國藥典》(2020年版)規(guī)定。

2.4揮發(fā)油含量測定 按照《中國藥典》(2020年版)通則2204揮發(fā)油測定法(乙法)依法測定。

2.5炒制工藝單因素考察 根據(jù)表2所設(shè)計(jì)的工藝條件安排實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值。以外觀性狀、阿魏酸和揮發(fā)油含量數(shù)據(jù)“歸一化”后的加權(quán)綜合評分為響應(yīng)值，采取單因素實(shí)驗(yàn)考察灶心土用量(A)、炒制溫度(B)和炒制時間(C)等對當(dāng)歸土炒工藝的影響。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 炒制條件單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1灶心土用量 如圖2所示，固定炒制溫度和炒制時間，響應(yīng)值隨灶心土用量的增加整體呈現(xiàn)的趨勢是先增加后不變。當(dāng)灶心土用量為0.30倍時達(dá)到最大值，隨即僅有微小變化。原因是灶心土應(yīng)與當(dāng)歸混合均勻且覆蓋充分；相反，灶心土用量過少，會使產(chǎn)品邊緣炒焦。因此，選取0.30倍量作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中灶心土用量的中心點(diǎn)。

2.5.2炒制溫度 如圖2所示，固定灶心土用量與炒制時間，在110～150 ℃范圍內(nèi)，響應(yīng)值隨炒制溫度的升高而升高，外觀性狀更加符合《全國中藥炮制規(guī)范》(1988年版)規(guī)定。當(dāng)溫度升至150 ℃以上時，其響應(yīng)值明顯下降。原因可能是當(dāng)歸所含阿魏酸及揮發(fā)油類成分穩(wěn)定性較差、經(jīng)高溫炒制后，其成分分解或揮發(fā)而使含量降低，且炒制品表面顏色加深、散發(fā)出炒焦的氣味。因此，選取150 ℃作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中炒制時間的中心點(diǎn)。

圖2 灶心土用量、炒制時間及炒制溫度對綜合評分的影響

2.5.3炒制時間 如圖2所示，固定灶心土用量及炒制溫度，響應(yīng)值隨炒制時間的延長整體呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢，當(dāng)炒制時間為8 min時達(dá)到最大值。高溫下長時間的炒制會造成阿魏酸和揮發(fā)油的分解或揮發(fā)，影響炮制效果。因此，選取8 min為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中炒制時間的中心點(diǎn)。

2.6響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與最佳工藝優(yōu)選

2.6.1響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken design中心組合設(shè)計(jì)原理，經(jīng)Design Expert 8.0.6版軟件設(shè)計(jì)出3因素3水平實(shí)驗(yàn)方案見表3。選擇灶心土用量(A)、炒制溫度(B)和炒制時間(C)作為考察因素，對所得供試品進(jìn)行外觀性狀打分，并測定阿魏酸及揮發(fā)油含量，設(shè)置各個指標(biāo)的權(quán)重，得出加權(quán)綜合評分(Y)為響應(yīng)值，優(yōu)化土炒當(dāng)歸的最佳炮制工藝。

表3 因素水平

2.6.2模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn) 按表4安排響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得1～17號土炒當(dāng)歸樣品，并進(jìn)行綜合評分。運(yùn)用Design Expert 8.0.6版軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，以加權(quán)綜合評分(Y)對各影響因素(A、B、C)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸及擬合，得到各因素與響應(yīng)值的擬合方程：Y=94.00-0.050A-9.50B+1.10C-0.17AB+0.015AC-3.34BC-1.94A2-10.87B2-3.80C2，R2=0.993 8。對模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析。由表5方差分析結(jié)果顯示，回歸模型F=124.26(P<0.000 1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明模型的殘差可能是隨機(jī)誤差產(chǎn)生的；炮制溫度、炮制時間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，灶心土用量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；交互項(xiàng)BC、二次項(xiàng)A2、B2、C2為顯著項(xiàng)，交互項(xiàng)AB、AC為不顯著項(xiàng)；該模型的失擬項(xiàng)P=0.072 3>0.05，無顯著性，說明該模型擬合較為合理，實(shí)驗(yàn)相對誤差較小。以上數(shù)據(jù)顯示，該模型能反映土炒當(dāng)歸炮制過程中各因素與響應(yīng)值之間的實(shí)際關(guān)系，并較好地對炮制工藝參數(shù)進(jìn)行分析與預(yù)測。

表4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與評分結(jié)果

表5 回歸模型方差分析結(jié)果

2.6.3響應(yīng)面圖分析 依據(jù)Box-Behnken design擬合出的回歸方程，分析灶心土用量、炮制溫度與炮制時間其中任意兩個因素與響應(yīng)值的三維響應(yīng)面圖及等高線圖(圖3)，采用Design Expert 8.0.6版軟件的響應(yīng)化功能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸模型預(yù)測。得到最佳工藝條件：灶心土用量為飲片量的0.30倍、炒制溫度為140.16 ℃、炒制時間9.44 min。總評歸一值的最大值為96.54分。結(jié)合藥廠生產(chǎn)實(shí)際操作的可行性，最終選擇灶心土用量為0.30倍，炒制溫度為135～145 ℃，炒制時間10 min。

圖3 不同因素對土炒當(dāng)歸綜合評分影響的三維響應(yīng)面圖及等高線圖

2.7炮制工藝驗(yàn)證 取同一批次當(dāng)歸飲片500 g，灶心土用量為0.30倍、炒制溫度為140 ℃、炒制時間10 min制備土炒當(dāng)歸，平行制備3批樣品。結(jié)果見表6，可知，土炒當(dāng)歸的實(shí)測值(97.37分)與總評歸一化預(yù)測值(96.54分)相接近，說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

當(dāng)歸作為一種藥食兩用的中藥，有益氣、活血、調(diào)經(jīng)、增強(qiáng)免疫力等功效。傳統(tǒng)的炮制理論認(rèn)為“土炒入脾”，采用土炒方法，當(dāng)歸入脾補(bǔ)血作用增強(qiáng)，緩和油潤，使補(bǔ)血而不滑腸。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸經(jīng)土炒后，阿魏酸與揮發(fā)油含量均有不同程度的降低，與傳統(tǒng)炮制理論吻合。

本研究采用多指標(biāo)、綜合評價的方法優(yōu)化土炒當(dāng)歸的炒制工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)中，炒制溫度、炒制時間對阿魏酸和揮發(fā)油含量影響較大。在響應(yīng)面法優(yōu)選最佳工藝實(shí)驗(yàn)中，所建立擬合方程R2=0.993 8，回歸模型F=124.26(P<0.000 1)，該模型擬合度高，能反映土炒當(dāng)歸炮制過程中各因素與響應(yīng)值之間的實(shí)際關(guān)系，并較好地對當(dāng)歸炮制工藝參數(shù)進(jìn)行分析與預(yù)測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，炒制溫度和炒制時間為顯著因素，灶心土用量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3種因素對其影響主次順序?yàn)椋撼粗茰囟?炒制時間>灶心土用量。最佳工藝為：將灶心土細(xì)粉(用量為飲片量的0.30倍)置于鍋內(nèi)，以140.16 ℃炒至松散，加入飲片，炒制9.44 min，取出，篩去多余土，晾涼。模型總評歸一化預(yù)測值96.54分，經(jīng)炮制工藝驗(yàn)證實(shí)測值為97.37分，實(shí)測值與預(yù)測值的相對誤差較小，說明該工藝條件穩(wěn)定可行。

在小試研究所提出的工藝參數(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合中試生產(chǎn)實(shí)際，對工藝進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，所優(yōu)選出的土炒當(dāng)歸炮制工藝穩(wěn)定、具體可控，可為土炒當(dāng)歸的工業(yè)化生產(chǎn)以及土炒當(dāng)歸在藥食兩用領(lǐng)域進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)及參考。