植物單倍體技術在林木育種中的應用研究

高孝華

（甘肅省子午嶺林業管理局華池分局，甘肅 慶陽 745600）

林業的發展對于我國國民經濟發展、生態環境、森林以及其他林產品的保護非常重要，關乎我國自然生態的可持續發展。為了提高我國林業管理效益，提升林木育種工作質量，必須不斷推進林木選種和育種的科學性和高效性，加強植物的遺傳分析工作。植物單倍體育種能夠獲得理想的純合二倍體植物，是一種理想的育種方式，不僅能夠控制雜交后的性狀分離，還能縮短育種周期，具有很強的實用性。

1 單倍體技術及其在林木育種中應用的意義

1.1 單倍體育種技術

林木育種是一種根據特定目的對供體植物的遺傳信息進行改良，使其表達出滿足人們需要的穩定性狀的技術。林木育種技術主要利用林木種群在自然以及人工誘導的條件下產生遺傳物質變異和分化，然后人們可以根據需要從所有類型中挑選并分離出滿足預定目標的個體或者群體，之后進行批量繁殖。因此，林木育種的最終目的是為林業創造出更加優質、高產和性狀穩定的林木品種以滿足人們生產和生活需要，且培育出的品種可適應自然生長以及栽培的優勢良種，這樣在實際應用中才能發揮出林木的自然生長潛能、森林豐富的效益。

植物的花粉（即雄配子）通過傳粉作用能夠與卵細胞（即雌配子）之間通過受精作用結合在一起形成受精卵，受精卵進一步發育成植物的種子。種子長成植株后，植株中的細胞包含來自精卵細胞的染色體，也就是父母雙方的兩套遺傳信息，遺傳學將其稱之為“二倍體”。雄配子（花粉）和雌配子（卵細胞）是植物的花粉母細胞和大孢子細胞通過減數分裂形成的，經過減數分裂后，花粉和卵細胞各自擁有來自親代1/2 的染色體，因此被稱為單倍體。植物可以通過雌雄配子受精作用形成新的植株，也可以由雌配子或雄配子直接形成植物體。單倍體植物無法結出具有遺傳作用的果實，但是在某些特殊的自然條件以及人工處理手段的作用下也可以使單倍體加倍，形成穩定性狀的純合子二倍體植物，這種方式產生的植物能夠正常結實且后代性狀不再發生分離。

利用人工作用誘導植物產生單倍體植株，再對其進行加倍處理形成穩定二倍體植物的技術就是單倍體育種技術，其能夠迅速培育出符合預期要求的穩定優良性狀的植物品種，而且相比自然雜交選育節省了更多的育種時間，提高了育種效率。單倍體育種技術已經在農作物育種以及林木育種中取得了不錯的成果，對于改善人類生活品質作出了巨大貢獻。

1.2 單倍體技術用于林木育種的意義

傳統的植物育種方式主要是利用優良品種自交選育以及優勢雜交育種這兩種方式來篩選性狀優良的穩定植株。然而以上兩種方式對于育種者的要求非常嚴格，需要育種者具備豐富的育種經驗，且育種周期非常漫長。

雜交育種的方式會使植物的后代出現性狀分離，要從中獲取穩定性狀，就需要5～6 代甚至更多代不斷進行雜交選擇；即使最終能夠得到復合預期目標的新品種，但是花費的時間以及投入的人力、物力等非常巨大，不滿足經濟、高效的要求，不利于商業化育種。假設能夠利用植物花粉或卵細胞直接培育單倍體植物，再利用人工對其進行加倍，就能很快得到類型豐富且不再進行性狀分離的純合二倍體植物，將這些植株進行繁殖后從中篩選良種進行培育，就能得到復合預期目標的優良植物品種，加快了育種速度，提高了育種效率。

為了得到滿足預期目標的穩定二倍體良種，雜交育種技術需要花費若干年的時間不斷進行良種自交，手續繁雜且耗時良久；利用單倍體誘導技術對植物進行染色體加倍，僅僅需要一年時間就能獲得標準自交系。人工誘導單倍體育種是獲得新品種的有效方式，對于林木育種來說，想要獲得穩定、優良的品種需要很長時間，但借助單倍體誘導，當代就能獲得性狀變異的植株，在選中優良的單倍體突變植株后立即進行染色體加倍處理就能得到完整的純合二倍體，因此是一種快速獲得良種林木的方式。

遠緣雜種的父母親代之間的遺傳物質不能融合，因此難以產生后代。但是遠緣雜種的植物花粉中有少數具備生活力，因此將這些具有生活力的花粉培育成單倍體植株后再對其進行染色體加倍，就能得到遠緣雜交的優良品種。由于林木不似一年生農作物品種能夠快速結實，林木生長周期十分漫長，因此一直以來人類難以解決林木育種中的遺傳學問題。單倍體育種技術的發展，為研究林木的遺傳變異規律提供了極大的便利和可能性，這對于林木遺傳學的發展和進步起到了推動作用[1]。

2 林木單倍體育種方式

誘導單倍體植物產生的方式主要有兩種，第一種是利用植物的雌配子進行誘導，被稱為孤雌生殖；第二種是利用植物的雄配子進行誘導，被稱為孤雄生殖。目前人們利用單倍體誘導的方式已經培育出了多種農作物，在林木育種中有了很多成果，如榆樹、楊樹、油松以及樟子松等林木都實現了單倍體育種。

2.1 雌配子體誘導產生單倍體

孤雌生殖就是將植物未受精的子房和胚珠單獨進行離體培養，誘導雌配子體通過單性發育長成再生植株。1976 年San Noeum 利用孤雌生殖的方式成功獲取了植物單倍體植株，后來人們陸續用孤雌生殖的方式培育了單倍體楊樹、橡膠以及刺槐等。目前生物遺傳學對于卵細胞的分離和培養仍然比較困難，培養具有8個卵細胞核的胚囊是誘導植物雌配子發育的方法。子房中的卵細胞、助細胞以及反足細胞都可以同時被誘導發育成為單倍體胚胎，但是只有卵細胞發育出的單倍體胚胎才是最終所需要的目標單倍體。在植物的花朵中，一個胚珠中僅有1 枚卵細胞，從數量上來講遠遠少于單個花藥中所含有的小孢子及花粉，這也是雌配子體誘導成功效率低于雄配子的原因之一。自然界中有一些植物天然具有孤雄生殖障礙或是缺少花粉，還有一些通過雄配子誘導后產生了白化苗，以上這些植物只能依靠孤雌生殖才能獲得單倍體，因為雌核培養的植株產生的單倍體遺傳性狀更加穩定，也不易出現白化苗。

實踐證實，誘導雌配子體發育具有內在的穩定性，這是因為胚囊發育不會因為離體條件的改變而限制胚珠發育出單倍體，而且實踐中雌配子體誘導的手段更多，誘導原理是讓雌花接受不能使雌配子受孕的花粉，這樣雖然沒有受精作用，但是雌配子體細胞受到刺激也會不斷分裂并生長成為完整的胚胎。

目前人工利用一些化學或物理方式也可誘導植物產生單倍體植株。上述方式屬于我國苗木培育中常用的方式，美國多選擇遠緣種間雜交的方式開展單倍體誘導。比如美國利用灰楊、銀白楊以及美洲黑楊中不能使雌配子受精的花粉作為誘導雌配子產生單倍體的父本，根據比例將其混合后為楊樹授粉，即可獲得楊樹的單倍體植株。

2.2 雄配子體誘導產生單倍體

誘導雄配子產生單倍體主要是將植物花粉與花藥，即雄配子進行離體培養，誘導其發育出單倍體植株。目前花藥離體培養和花粉離體培養是人工干預使植物通過孤雄生殖方式發育出單倍體的兩個主要途徑。花粉離體培養屬于對生殖細胞進行培養，所有植物的再生植株都是經過雄配子發育而來的單倍體。花粉培養的難度較大，成功率低，不適宜商業化使用。花藥離體培養是目前應用較為廣泛的單倍體培養方式，屬于器官培養，得到的單倍體植物植株有可能來自于花粉，也有可能來自花藥內體細胞。優點是操作簡單、成功率高，因此目前應用的范圍比較廣泛。在花藥離體培養的過程中，花藥和花粉通過細胞分裂與增殖，會形成愈傷組織，愈傷組織不斷發育最終長成完整的單倍體植株，花粉在此過程中可以直接生成胚體，形成單倍體植株。下面介紹花藥離體培養的步驟。

1）制備培養基。花藥離體培養選用的是LB 培養基，在培養基中加入2，4-D 等合適的生長素，再添加一些細胞分裂素促進細胞分裂繁殖，調節培養基pH值為6 的弱酸性環境，添加1%瓊脂并置于熱壓環境下滅菌15 min。培育期間，在誘導植物花藥發育出愈傷組織后，再補充培養基內的生長素、細胞分裂素進一步促進細胞分裂分化。觀察到愈傷組織分化出根和芽后，再次補充少量細胞生長素[2]。

2）接種花藥使之發育出愈傷組織。在花粉由四分孢子期至單核靠邊期，將花芽置于漂白粉溶液中消毒10 min，再無菌漂洗幾次。接著剝開花芽的芽鱗，將花藥接種到花芽中，置于適宜生長環境下培養，等待植物長出愈傷組織。

3）誘導愈傷組織，促進花芽分化出根和芽。花藥及花芽發育出愈傷組織后，待愈傷組織長成黃豆粒大小時，可以手動將愈傷組織轉移到第一步培養基中進一步培育。日間溫度在25～30 ℃，夜間溫度在15～20 ℃，每日保持充足的光照時間，時間約為10 h。期間必須保障培養基內營養物質充足，及時補充營養成分和細胞分裂素，保障愈傷組織能夠正常分裂分化。待愈傷組織分裂出完整的根和芽，且生長情況良好，可將其移出置于花盆中繼續培養。

4）染色體檢查。愈傷組織發育出根和芽即代表單倍體植株發育成功，但是愈傷組織幼苗并非源于同一品種林木，因此在培育時必須要對染色體進行檢查，觀察其染色體數目，分辨出可能的林木種類。在檢查的過程中，從愈傷組織生長態勢較好的區域邊緣處取下一小部分作為檢查樣本，將樣本置于1%醋酸洋紅溶液中進行染色，制片，在電子顯微鏡下觀察幼苗的根尖，分辨染色體數目。

2.3 單倍體植株染色體加倍

培育出符合預期目標的單倍體植株后，需要對單倍體進行加倍，使其成為性狀穩定的二倍體。在生物學上，選用秋水仙素溶液對單倍體植物進行浸泡，或在植物生長點上涂抹含有秋水仙堿的羊毛脂，在這兩種方式中秋水仙素和秋水仙堿的濃度一般為0.1%～0.4%，均可以促進單倍體植物的染色體加倍。單倍體植株或愈傷組織在細胞分裂素培養基生長的過程中，有時也會出現染色體自然加倍的現象。在進行染色體加倍操作后，單倍體植株會形成純合的二倍體植物，后代不再發生性狀分離。待植物生長穩定后，可以根據預期目標選取滿足需求的植物，進行直接栽培或是進一步雜交來確保其擁有良好的品質[3]。

3 花藥培養在林木育種中的應用

3.1 林木育種中花藥培養的現狀

單倍體技術在林木培育中的應用最早是1964 年印度科學家利用曼陀羅花粉實現的。1974 年，日本科學家利用花藥離體培養技術成功對楊樹進行了離體培養，但是并沒有發現單倍體。王敬駒（1975）利用花藥離體培養獲得了穩定的黑楊單倍體植株。此后，花藥離體培養技術在林木育種中得到了廣泛的應用，橡膠、樟子松等林木均可以通過此方式獲得單倍體植株。在實際應用中，林木不同于農作物，其生長周期較長，且植物的生理狀態與生長環境（如溫度、降水量以及光照）等都有很大的關系，這些外界的環境會影響花藥離體培養的最終結果，進而導致實驗難以重復，阻礙了花藥培養在林木育種中的大范圍應用。目前，人類利用花藥離體培養的方式成功獲得的單倍體植物有楊柳科的黑楊，遼楊、山茶科的茶樹，蕃蔽科的蘋果、大戟科的橡膠等，種類豐富，優良品種和成果較多。尤其是其中的三葉橡膠、楊樹，因為早些年人類對其研究開展的種類較多且時間久，目前研究已經達到一定深度，后續也將加大研究力度。

3.2 當前林木育苗中花藥培養的缺陷

花藥離體培養技術已經是目前能夠獲得純合基因型的最有效和經濟的方式，然而花藥離體培養仍然存在一些缺陷。

首先，供體植物本身的類型和基因型對于配子離體培養的成功率和效率起到了直接的影響，尤其是雄配子誘導具有強烈的物種依賴性，不同的物種之間對于花藥和小孢子的應答有所差別。花藥離體培養具有很強烈的基因型依賴性，所以物種之間的基因差異是導致花藥離體培養結局的主要原因。同時，由于花藥離體培養并不能打破不良基因連鎖，導致基因之間的重組概率減少，很多的豆科植物和林木都會被視為頑拗基因型，只有很少一部分花藥能夠成功培育出單倍體植株。林木本身的生長狀態對于單倍體培養結果也會造成很大的影響，由于花藥中的小孢子數量、活力以及營養狀況等都具有差異，這些都會影響雄配子的生長和發育，最終影響單倍體植株的誘導成功率。一般而言，植物在自然界中生長比其在溫室中培養更加容易存活，自然環境下的植物雄配子誘導效率更高，可以說自然環境是最天然高效的花藥發育環境，而且林木的生長周期較長，體積大，很難完成溫室種植，因此自然環境更有利于林木花藥的繁育。但林木植株難以通過人工來改善環境溫度和光照促其生長，難以控制植物的生理狀態，而且在自然環境中花藥的取材耗時長，受到環境的影響較大，質量參差不齊，這些問題會導致花藥離體培養的周期不斷加大。

其次，花藥發育出愈傷組織后，對其進行人工誘導使其繼續分裂分化的難度大，即使分裂分化出根和芽，得到的后代植株混亂、染色體倍數不清晰是當前花藥離體培養面臨的難題。花藥離體培養是器官培養類型。植物的花藥中除了小孢子之外，還有花藥壁、花絲等體細胞，這些體細胞的生長和分裂會干預小孢子的分裂，最終得到的愈傷組織也有極大可能是由體細胞發育而來。體細胞愈傷組織分化得到的單倍體植株的生活力弱、增殖比較慢，無法與二倍體細胞競爭導致后續被二倍體愈傷組織取代，使單倍體培育失敗。

再次，愈傷組織在培養中有可能自然形成染色體加倍，產生多倍體的胚胎，這種自然加倍的情況會干擾花藥離體培養的結局，降低成功概率。

4 林木單倍體育種前景與展望

首先，通過改良植物基因提高林木的培養效率。花藥離體培養的工作重點是選取性狀表現優良、再生頻率高的基因型，而不是將重點研究放在改善頑拗基因型培養條件上。開展花藥離體培養時，反應較差的基因型可以通過雜交育種來促進雄配子發育，例如科學家通過對柑橘的雜種花藥培養得到了三倍體的柑橘純合子愈傷組織。因此，在培育林木時，應該開拓思維方式，將多種培育方式有機結合，優化培養方式增加成功率，將雜交方式和單倍體誘導方式結合使用是單倍體育種值得借鑒的方式。

其次，優化林木的花藥離體培養方式，減少體細胞的干擾。在花藥培養中，小孢子發育時容易受到體細胞分裂分化的影響。為了減少這種不良影響，可以對花藥使用固液雙層培養來進行培育。這樣處理后，花藥正常開裂并且不會產生愈傷組織，成功避開體細胞影響，不會對小孢子細胞造成傷害。

再次，應強化對于林木花藥培養機理的研究。當前在花藥離體培養的過程中，再生出的植物植株染色體倍數混亂，因此需要加強對于林木花藥培養的理論研究，借助現代分子生物技術手段，拓展單倍體花藥的獲取方式，對各種林木適宜的培養環境有系統性認識，促進林木育種工作更進一步發展。