蚯蚓對亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化效果的研究

吳麗娟，雷小文，劉珍妮，譚東海，謝華亮，鐘云平，黎觀紅，張泳楨，王文海，鄧茂林，李建軍*

(1. 贛州市畜牧水產(chǎn)研究所，341000，江西，贛州；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，330045，南昌；3. 瑞金市杰仕柏蚯蚓養(yǎng)殖有限公司，342500，江西，贛州)

0 引言

硒是生命體重要的營養(yǎng)元素，對動植物體免疫、抗氧化及生長發(fā)育和繁殖等方面均有積極的作用[1-2]。中國作為公認的缺硒大國，72%的地區(qū)屬于低硒或缺硒地區(qū)，且土壤中有效硒含量只占總硒的1.7%～5.5%，植物難以吸收轉(zhuǎn)化利用[3]。食物是人體補硒的重要途徑，而土壤缺硒會通過食物鏈影響動植物體中硒的含量。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國不同地區(qū)居民平均硒攝入量僅為43.3 μg/d，遠低于成人推薦硒攝入量60～400 μg/d[4-5]。因此，需要通過提高土壤及膳食中硒的含量來改善人體硒攝入不足的營養(yǎng)問題。

有機硒一般以硒蛋白、硒氨基酸和硒多糖等形式存在，與無機硒相比，具有毒副作用小、活性強及吸收率高等優(yōu)點，是人體及動植物最佳的營養(yǎng)硒源。蚯蚓體含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，具有促進畜禽生長、提高免疫功能和維護腸道健康的功能，是一種綠色安全高效的飼料添加劑[6-8]。蚯蚓糞是蚯蚓體的代謝物，富含氮、磷、鉀等可溶性鹽及植物生長激素、腐殖酸、氨基酸、土壤酶、有機質(zhì)等物質(zhì)，且含有數(shù)量龐大、種類豐富的微生物群體[9-12]，同時兼具了生物有機肥、氨基酸肥和腐殖酸肥等肥料的特性，是一種高效的有機肥。蚯蚓體對硒具有很好的轉(zhuǎn)化作用，在蚯蚓基料中外源添加無機硒，蚯蚓體能將無機硒高效轉(zhuǎn)化為有機硒[13-14]，且對蚯蚓糞中硒的含量也有積極作用[15]。岳士忠[16-17]指出低濃度的亞硒酸鈉(0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)對蚓體生長繁殖沒有影響，且隨著外源硒添加濃度的升高，蚓體總硒及有機硒含量也增加，但未分析高濃度對蚓體生長繁殖情況及蚓糞中硒轉(zhuǎn)化效果。劉軍[18]研究表明，在牛糞中添加40 mg/kg的亞硒酸鈉可顯著提高蚓體和蚓糞中總硒及有效硒的含量，但未系統(tǒng)分析不同硒添加濃度對蚓體和蚓糞中硒的轉(zhuǎn)化效果以明確硒的最佳添加濃度。本研究以太平2號蚯蚓為試驗材料，牛糞為蚯蚓養(yǎng)殖基料，探討不同濃度亞硒酸鈉對蚯蚓體及蚯蚓糞硒的轉(zhuǎn)化效果，并結(jié)合蚓體生長的情況，尋求亞硒酸鈉適宜添加濃度，旨在為含硒蚯蚓體作為飼料添加劑和含硒蚯蚓糞作為有機硒肥的開發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蚯蚓(太平2號)由瑞金市杰仕柏蚯蚓養(yǎng)殖有限公司提供，單條體重約為0.12～0.13 g；牛糞，經(jīng)陳化1個月，自然風(fēng)干，過4 mm篩，由瑞金市杰仕柏蚯蚓養(yǎng)殖有限公司提供；亞硒酸鈉購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置6個處理組，分別為Se0(發(fā)酵牛糞)，Se20(20 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se40(40 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se60(60 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se80(80 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se100(100 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)。

1.3 試驗方法

蚯蚓養(yǎng)殖：取適量亞硒酸鈉溶于去離子水中配制成硒濃度為2 g/L的溶液，分別取0 mL、50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL配好的硒溶液加入到5 kg(干重)牛糞中得到硒濃度分別為0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg和100 mg/kg的培養(yǎng)基料，每個濃度做3個重復(fù)，各組水分控制在55%～65%左右，陳化1周。參照劉向輝等[19]試驗方法，采用模擬蚯蚓室外養(yǎng)殖方法，在溫室大棚中隔出長80 cm×寬60 cm×高60 cm的蚯蚓飼養(yǎng)床，床底部鋪一層不漏水的塑料膜(防止硒流失)，然后放入陳化好的基料，每床分別接種500 g太平2號蚯蚓，做好標記，同時，每床分別隨機挑選100條蚯蚓，稱重，并記錄；在大棚中培養(yǎng)58 d(18～20 ℃)，每天噴少量的水以保持基料的濕度(55%～65%)。

蚓體和蚓糞收集：采用懼光法，將蚯蚓和基料平鋪在塑料薄膜上，設(shè)置好燈光，逐層去除表層基料，反復(fù)多次，即可獲得蚓體和蚓糞。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 蚓體重量的測定 培養(yǎng)58 d后，收集所有蚓體，稱取總重，并記錄。

1.4.2 單條蚓體增重的測定 培養(yǎng)前和培養(yǎng)58 d后，每床分別隨機挑選100條蚯蚓，稱重，并記錄。單條蚓體增重百分比=(培養(yǎng)后百條重-培養(yǎng)前百條重)/100*100%。

1.4.3 蚓體和蚓糞總硒及無機硒含量的測定 培養(yǎng)58 d后，每床隨機挑15條蚯蚓，黑暗環(huán)境下清腸12 h，去離子水清洗干凈，濾紙擦干，冷凍干燥，備用。每床收集50 g蚓糞，自然風(fēng)干，備用。分別參照GB5009.93—2017中電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS法)測總硒含量和參照劉軍[18]試驗方法測無機硒的含量。

蚓體有機硒的含量=蚓體總硒含量-蚓體無機硒含量；

蚓糞有機硒的含量=蚓糞總硒含量-蚓糞無機硒含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel和SPSS17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差(SD)表示，采用One-Way ANOVA 進行方差分析，采用最小顯著極差法(LSD)對差異顯著的數(shù)據(jù)進行多重比較，P< 0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒處理對蚯蚓生長的影響

如圖1所示，與培養(yǎng)前的500 g蚯蚓重量相比，Se0、Se20、Se40、Se60、Se80和Se100 6個組的蚯蚓重量均有所增加。培養(yǎng)至58 d時，與未添加亞硒酸鈉的Se0相比，Se20和Se40蚯蚓重量分別增加1.07%和8.13%，其中Se40與Se0組相比差異極顯著(P<0.01)；而Se60、Se80和Se100的蚯蚓重量分別降低了14.37%、35.54%和17.76%(P<0.01)。

圖1 不同濃度硒處理對蚯蚓重量的影響

如圖2所示，與培養(yǎng)前相比，Se0、Se20、Se40、Se60、Se80、Se100 6組蚯蚓單體增重率分別為88.41%、108.14%、105.36%、60.21%、86.75%、83.27%。與對照組Se0相比，Se20和Se40組的蚯蚓單體增重率有上升的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；與Se20和Se40組相比，Se60組蚯蚓單體增重率顯著降低(P<0.05)；與Se60組相比，Se80和Se100組蚯蚓單體增重率有上升的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；Se80和Se100組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同濃度硒處理對蚯蚓單體重量的影響

2.2 硒處理對蚓體中轉(zhuǎn)化效果的影響

如表1所示，蚓體培養(yǎng)58 d后，隨著硒添加濃度的升高，蚓體中總硒和有機硒含量均顯著增加。與對照組Se0相比，Se20、Se40、Se60、Se80、Se100 5個組蚓體總硒的含量分別極顯著提高了2.57倍、7.44倍、11.6倍、14.18倍、15.1倍，而蚓體有機硒含量分別顯著提高了4.93倍、8.04倍、14.2倍、18.22倍、18.67倍，其中Se100組蚓體總硒和有機硒含量均最高，分別為148.88 mg/kg和99.78 mg/kg。Se60組相較于Se20、Se40組，蚓體總硒和有機硒含量均極顯著提高(P<0.01)。Se80、Se100與Se60組相比，蚓體總硒含量分別顯著提高了22.23%(P<0.05)和30.13%(P<0.05)，蚓體有機硒含量分別提高了20.62%(P>0.05)和31.47%(P<0.05)，而Se80和Se100 2組間蚓體總硒與有機硒含量變化均不顯著(P>0.05)；由此可見，隨著硒添加濃度的升高，蚯蚓體中總硒及有機硒含量的增加速率變緩。另外，還可以看出，蚓體中有機硒占總硒百分比在51.38%～67.02%之間波動。Se0、Se20、Se40 3個處理組有機硒占總硒百分比沒有明顯的差異，當(dāng)硒添加濃度達到60 mg/kg時，蚓體有機硒占總硒百分比相對于對照組Se0有顯著的提高(P<0.05)，且隨著硒添加濃度的升高，有機硒占百分比略微有所提高，但不顯著(P>0.05)。

表1 亞硒酸鈉處理對蚓體硒含量的影響/mg·kg-1

2.3 硒處理對蚓糞中硒含量的影響

如表2所示，隨著硒添加濃度的升高，蚯蚓糞中的總硒和有機硒的含量均顯著增加，但其增加速率逐漸變緩。當(dāng)硒添加濃度為100 mg/kg時，蚯蚓糞中總硒和有機硒含量達到最高，分別為115.48 mg/kg和95.97 mg/kg，與Se80相比，總硒含量呈極顯著增加(P<0.01)，有機硒含量呈顯著增加(P<0.05)。另外，從蚯蚓糞中有機硒占總硒百分比可以看出，通過外源添加亞硒酸鈉可顯著提高蚯蚓糞中有機硒的占比率，其中當(dāng)硒添加濃度為40mg/kg時，蚯蚓糞中有機硒占總硒百分比最高，為94.26%；之后，隨著硒添加濃度的升高，蚯蚓糞中有機硒占比呈下降趨勢。與Se40相比，Se100組中有機硒占比顯著下降了6.45%(P<0.05)。

表2 亞硒酸鈉處理對蚯蚓糞硒含量的影響/mg·kg-1

3 討論

3.1 硒處理對蚯蚓生長的影響

硒是動物體生長的必要營養(yǎng)元素，但硒劑量過大會對機體生長產(chǎn)生抑制和毒害作用。大量試驗研究表明，過量的硒對蚯蚓的生長具有毒害作用。劉向輝等[19]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg的亞硒酸鈉均對蚯蚓具有顯著的毒性作用，且亞硒酸鈉添加濃度越高，蚯蚓的死亡率也越大。孫曉斐等[16]和劉軍[18]研究結(jié)果也表明，硒添加濃度分別為100 mg/kg和200 mg/kg時，蚯蚓的生長受到顯著的抑制作用。本試驗得出類似的結(jié)果，即蚯蚓總重量隨著硒添加濃度的升高表現(xiàn)為先升后降，但均為正向增長。其原因可能是由于低濃度硒對蚓體的生長具有促進作用，但高濃度硒會破壞蚓體的代謝平衡，對幼蚓的生長、成蚓及其產(chǎn)繭能力均產(chǎn)生了抑制和毒害作用，造成蚯蚓產(chǎn)繭率下降、幼蚓及部分成蚓逃逸或死亡[20-22]；另外可能是由于飼養(yǎng)環(huán)境的不同，使得本試驗中所有組均為正向增長。而Se100組總重量相較于Se80組稍有增加，分析原因可能是成蚓對高濃度硒產(chǎn)生一定的耐受作用，但這還需進一步試驗研究。同時，蚯蚓單體增重顯示了與蚓體總重量大體一致的規(guī)律，當(dāng)硒添加濃度為80 mg/kg及以上，蚯蚓單體增重有上升的趨勢。這可能是由于幼蚓及蚓繭對高濃度硒更敏感，而成蚓對高濃度硒耐受性更強，導(dǎo)致存活下來的蚯蚓基本為個體更大、耐性更強的成蚓。

3.2 硒處理對蚓體中轉(zhuǎn)化效果的影響

在本試驗中蚯蚓體對硒表現(xiàn)出很好的轉(zhuǎn)化作用，且硒的轉(zhuǎn)化量隨著硒添加濃度的升高而增加。同時，蚓體中有機硒的含量也顯著增加，當(dāng)硒添加濃度達到100 mg/kg時達到最高，但增加率相對有所變緩，這可能是由于高濃度硒影響了蚓體的生長代謝功能，而導(dǎo)致蚓體對無機硒利用率逐漸下降。另外，在本試驗中蚓體有機硒含量占總硒百分比只有51.38%～67.02%，與前人報道[13,17](91%～93%)的有一定的差距，這可能是受飼養(yǎng)環(huán)境條件的影響限制，導(dǎo)致部分亞硒酸鈉進入蚓體內(nèi)未被吸收利用，蚓體對無機硒的轉(zhuǎn)化利用率不高，后期還需結(jié)合蚓體轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化進一步深入研究蚓體的轉(zhuǎn)化機制。

3.3 硒處理對蚓糞中硒含量的影響

現(xiàn)階段，為改善我國土壤缺硒的情況，部分地區(qū)主要通過施用無機硒肥和有機硒肥來提高土壤中硒的含量[23]。與有機硒肥相比，植物對無機硒肥轉(zhuǎn)化利用率更低，長期的使用容易造成土壤中硒含量超標，這既不利于植物的生長，也會對生態(tài)環(huán)境造成了嚴重污染[24-26]。在本試驗中，通過硒元素與蚯蚓堆肥的聯(lián)合利用，可有效提高蚯蚓糞中總硒及有機硒的含量，且有機硒含量占總硒百分比最高可達94.26%。這與前人的研究報道不同，即認為硒元素與蚯蚓堆肥的聯(lián)合利用后，蚓糞中主要以無機硒為主[17-18]。從本試驗數(shù)據(jù)可以看出，未添加外源硒的蚯蚓糞中有機硒含量占總硒百分比也有80.99%，這說明經(jīng)蚯蚓代謝后的牛糞中可能存在一定比例富硒能力較強的微生物菌群，并在通過外源添加亞硒酸鈉進行硒強化后，顯著提高了蚓糞中有機硒轉(zhuǎn)化率。同時，蚯蚓體有機硒主要以硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)的形式存在[27-28]，本試驗條件可能會刺激蚯蚓分泌有機硒轉(zhuǎn)化所需要的酶，并促進其高效分解牛糞中的有機質(zhì)而產(chǎn)生了大量的氨基酸，為無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，但還需進行深入研究。而硒添加濃度達到100 mg/kg時，有機硒含量的占比有下降的趨勢，這可能與高濃度硒抑制蚯蚓及微生物菌群的生長代謝有關(guān)。因此，結(jié)合蚯蚓糞與硒的功能性作用，有可能將含硒蚓糞開發(fā)作為富硒農(nóng)作物的有機硒肥，并利用蚯蚓堆肥技術(shù)緩解土壤硒污染問題。

4 結(jié)論

在大棚飼養(yǎng)條件下，以發(fā)酵牛糞為基料，通過添加不同濃度的外源硒飼養(yǎng)蚯蚓58 d后，隨著硒添加濃度的升高，蚓體的生長規(guī)律表現(xiàn)出先促進后抑制的變化，但均為正向生長。同時，蚓體和蚓糞中總硒和有機硒的含量，隨著硒添加濃度的升高而顯著增加，增加率表現(xiàn)出先增后減的趨勢；當(dāng)硒添加濃度為100 mg/kg時，蚓體和蚓糞轉(zhuǎn)化效果最佳，蚓體中總硒含量為148.88 mg/kg，有機硒含量為99.78 mg/kg；蚯蚓糞中總硒含量為115.48 mg/kg，有機硒含量為95.97 mg/kg。綜上所述，在本試驗條件下，當(dāng)硒添加濃度為100 mg/kg時，蚓體和蚓糞中有機硒的轉(zhuǎn)化效果最好。