基于NF-κB熒光蛋白報告基因抗腫瘤藥物篩選平臺的建立

王瑞萍，程浩杰，余 靂，黃明敏，譚擁軍

（湖南大學生物學院，長沙 410082）

近年來，隨著惡性腫瘤的發病率逐漸增高［1］，癌癥成為僅次于心腦血管疾病致死率第二的“殺手”，使人類健康受到嚴重的危害，因此，抗腫瘤藥物的研發迫在眉睫。據統計，目前國際上常見的臨床抗腫瘤藥物約80余種［2］，大致可分為6類：細胞毒類藥物［3］、激素類藥物［4］、生物反應調節劑［5］、單克隆抗體藥物［6］、其他類藥物、輔助藥。為提高新藥的研發速度，降低癌癥的死亡率，建立一種高效的藥物篩選平臺是很有必要的。

目前，藥物篩選平臺可分為3類：基于靶點的細胞模型［7］、基于表型的細胞模型［8］、抗病毒藥物篩選的細胞模型［9］。其中，基于靶點的細胞模型是目前用于藥物篩選的主要模型，根據靶點的不同可以分為4類：以受體為靶點的細胞模型、以通道為靶點的細胞模型、以信號通路為靶點的細胞模型、以報告基因和其他類型連用為靶點的細胞模型。事實上，前3種藥物篩選細胞模型通常均是與報告基因聯用建立起來的，這樣可以快速且直觀地觀察到藥物作用于細胞后的變化。

常用的報告基因有5種，分別是熒光素酶（luciferase，Luc）［10］、 氯霉素乙酰轉移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）［11］、 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）［12］、 分泌性人胎盤堿性磷酸酶（secreted alkaline phos-phatase，SEAP）［13］和GFP［14］。這些報告基因在細胞內受到調控后表達量的改變可對應于它們的酶活性或發光強度的改變。對螢火蟲熒光素酶和海參熒光素酶而言，檢測利用的是它對底物的發光強度；對β-半乳糖苷酶報告基因而言，利用的是它催化底物后的顯色反應；對于GFP等熒光蛋白而言，則利用的是它們被激活后特定波長的發光強度。在試驗時可根據報告基因質粒的使用方便性、成本及現有條件進行選擇。

這些報告基因的工作原理［15］是通過把已確定的順式調控序列剪接到報告基因上來控制基因的活性。這些反應元件可以對宿主細胞中基因調控和表達的變化起反應，因此就可以直觀地報道細胞內與基因表達有關的信號級聯。

在細胞中，NF-κB的活性水平與腫瘤的發生發展密切相關［16］。如在乳腺癌、結腸癌、淋巴癌等癌癥中，NF-κB的持續性激活可導致與細胞周期相關的蛋白活性異常，如周期蛋白D1（cyclinD1）、周期蛋白依賴激酶Cdk2（cyclin-dependent kinases）、c-myc等［17］；其次，持續性激活的NF-κB能提高一些促進腫瘤生長的細胞因子水平，如IL-1β（急性白血病生長因子）、TNF（惡性淋巴肉芽腫瘤、T細胞淋巴癌、神經膠質瘤生長因子）、IL-6（多發性骨髓瘤的生長因子）［18］；此外，在腫瘤細胞的生長和組織侵潤過程中，NF-κB參與調節新血管生成的相關蛋白的基因表達，如血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），持續性激活的NF-κB能增強VEGF基因的轉錄［19］；最后，NF-κB的持續性激活也能導致細胞的抗凋亡，抵抗化療藥物的誘導凋亡作用［20］。因此，NF-κB是研究抗腫瘤藥物的關鍵靶點之一［21］。

為了高效地篩選出以NF-κB為靶點的抗腫瘤藥物，根據報告基因質粒的工作原理，本課題成功構建了pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒，用于指示細胞中NF-κB的轉錄活性水平，并且使用一線抗癌藥物如雷帕霉素［22］、紫杉醇［23］、吉西他濱［24］及本實驗室研究開發的多肽類藥物M1-20［25］、M1-21［26］，驗證了該報告基因體系的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK-293T細胞購自美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。DH5α感受態、pGL6-Enhancer、金牌Mix、GFP抗體、Rabbit二抗購買于碧云天生物技術公司；BamH I、Hind III限制性內切酶購自Thermo fisher；T4 DNA Ligase 購自Ferments公司；PCR引物、1kb Marker購自北京擎科生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自Omega；Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）以及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒的構建與鑒定

以實驗室保存的pcDNA3.1-Flag-GFP質粒為模板擴增GFP基因。上游引物為AAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA，下游引物為GGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCA。PCR反應體系（50 μL）：上游引物 F 2 μL、下游引物 R 2 μL、模板 50 ng（1 μL）、金牌Mix 45 μL。擴增條件為98℃ 2 min、98℃ 10 s、65℃ 10 s、72℃ 10 s、72℃ 5 min，30個循環。將PCR擴增產物做膠回收，隨后用BamH I和Hind III限制性內切酶對膠回收產物及pGL6-NF-κB-Luc質粒進行雙酶切，用1%的瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段，用T4 DNA連接酶22℃、2 h水浴連接，連接后的產物加入50 μL DH5α感受態進行轉化、涂板、挑取單克隆、搖菌，送擎科生物有限公司測序，測序正確的菌液進行質粒小提。

1.2.2 報告基因質粒的轉染與檢測

HEK-293T細胞用體積分數為10%的FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基培養，待細胞長滿培養皿后，傳代到6 cm盤中；細胞密度達到80%～90%時，轉染6 μg pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒；12 h后去除培養基，用1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗一遍細胞，更換新鮮培養基；待36～48 h后用熒光顯微鏡觀察細胞拍照。然后收集細胞，加300 μL IP（immunol precipitation）細胞裂解液和3 μL蛋白酶抑制劑，冰上裂解20 min，15 000 r/min、4℃離心10 min，取上清，即為細胞中的蛋白；加入5×蛋白電泳上樣緩沖液，于100℃金屬浴中10 min進行蛋白變性，通過蛋白質印記（Western blot，WB）檢測GFP蛋白。

1.2.3 細胞流式分析

將HEK-293T細胞接種于6 cm盤中，待細胞密度達到80%～90%時，轉染pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒6 μg；12 h后換新鮮培養基，48 h后用0.5%的胰酶將細胞消化下來，用1×PBS清洗細胞2次，最后用500 μL的1×PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀上機檢測表達GFP細胞的比例。

1.2.4 抗腫瘤藥物的篩選

將HEK-293T細胞接種于6孔板中，待細胞密度達到80%～90%時，每孔轉染pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒3 μg；12 h后換新鮮的培養基，同時，分別加入0.04 μmol的紫杉醇、0.02 μmol的吉西他濱、20 μmol的雷帕霉素、10 μmol的M1-20、10 μmol的M1-21處理細胞24 h，收集細胞進行流式檢測，同時收集蛋白，通過WB檢測細胞中GFP蛋白表達量的變化。

2 結果與分析

2.1 報告載體的調控模式

報告載體包括最基本的兩個部分，即響應序列和報告基因。通過把已確定的順式調控序列剪接到報告基因上來控制基因的活性，這些反應元件可以對宿主細胞中基因調控和表達的變化起反應，從而就可以直觀地報道細胞內與基因表達有關的信號級聯（圖1）。

圖1 報告基因載體工作模式圖Fig.1 Shows a pattern of gene vector operation

2.2 NF-κB報告基因質粒的構建

pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒的構建是以pGL6-NF-κB-Luc為載體，酶切去除Luc基因，同時將GFP基因連接在響應序列之后。pGL6-NF-κBGFP報告基因質粒的調控模式及報告序列（圖2a、2b）、質粒圖譜（圖2c）和單克隆測序結果（圖2d）證明了質粒構建成功。

圖2 報告基因質粒的構建Fig.2 Construction of the reporting gene plasmid

2.3 pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒的驗證

在HEK-293T細胞中轉染構建成功的pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞（圖3a），結果顯示，細胞呈現綠色熒光，證明報告基因質粒在細胞內可正常表達。同時為進一步證明構建質粒的正確性，收取轉染報告基因質粒的細胞蛋白做WB分析（圖3b），通過抗體進一步證明GFP基因的表達及所構建的質粒在細胞內可以正常響應。最后，用流式細胞儀對轉染的細胞進行定量分析（圖3c），結果同樣證明了報告基因質粒的正確性。

圖3 報告基因質粒的驗證Fig.3 Validation of the reported gene plasmid

2.4 pGL6-NF-κB-GFP報告基因體系響應抗腫瘤藥物

為證明構建成功的pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒可以做為抗腫瘤藥物篩選的工具，在體外培養的HEK-293T細胞中轉染pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒，然后使用臨床上常用的抗癌藥物紫杉醇（0.04 μmol）、吉西他濱（0.02 μmol）、雷帕霉素（20 μmol）、M1-20（10 μmol）、M1-21（10 μmol）處理細胞，進行流式細胞分析（圖4a）以及WB檢測GFP蛋白的表達量（圖4b），探究此類抗腫瘤藥物對細胞中NF-κB轉錄活性的影響。其結果為紫杉醇、吉西他濱、雷帕霉素、M1-20、M1-21均抑制NF-κB的轉錄活性。該結果證明了報告基因體系可以正常響應抗腫瘤藥物。

圖4 抗腫瘤藥物對NF-κB信號通路的影響Fig.4 Effects of antineoplastic drugs on the NF-κB signaling pathway

3 討論

腫瘤是一種嚴重危害人類健康的疾病［27］。幾十年來，人們一直在開發研究新的藥物以期能有效抑制腫瘤的惡性增長。在研究過程中，尋找一種能快速篩選出有效的抗腫瘤藥物的有效方法極為重要。現如今，常用的一些篩選體系可以分為生化篩選體系和細胞篩選體系兩大類。基于細胞的篩選方法包括細胞活力（cell viability）、報告基因（reporter gene）、第二信使（second messenger）、高通量顯微鏡篩選（high-throughput microscopy assays）和基于CRISPR/Cas9系統的篩選。而基于報告基因建立的藥物篩選平臺，應用熒光或化學發光法對報告基因進行檢測更簡單、更靈敏。如Zlokarnik等［28］在進行轉錄定量和單一活細胞克隆篩選的研究中，用β內酰胺酶基因作為報告基因，在細胞株轉染受體表達后，再轉染構建好的NF-κB內酰胺酶質粒。報告基因的表達產物可以水解細胞內的一種跨膜脂蛋白，每一個酶分子可以催化很多底物分子的化學鍵斷裂，從而改變底物分子的共振能。在哺乳動物細胞中，這種變化可以通過胞內顏色由綠到藍的改變來探測到。報告基因可以實時檢測細胞活動和生理化學物質的變化情況，并且具有實時性、可靠性等優點，因此，在植物基因工程、動物基因工程等中也被廣泛應用。

用報告基因對候選藥物進行篩選，其最大的優點在于整個篩選過程可以直接在存活細胞中進行，不必破碎細胞，報告基因表達的定性定量分析可以簡單地通過胞內顏色的變化來探測。如采用不同藥物處理細胞，根據報告基因質粒的表達情況判斷藥物分子對細胞的影響，從而篩選得到有效的藥物，或者用同一藥物分子處理細胞，檢測不同報告基因質粒的表達，判斷該藥物對細胞中某些信號通路或關鍵基因表達的影響，進而高效地篩選出抗腫瘤藥物。但是報告基因系統也存在一定的缺陷，如這種瞬時轉染的方法不能建立穩定篩選的細胞株，每次篩選都要重新轉染，此外，對一些難轉染的細胞（如原代細胞、不分化的細胞等）會出現轉染效率低下及浪費昂貴的轉染試劑等問題。

在本文中，我們運用基因工程技術［29］，基于pGL6-NF-κB-GFP報告基因質粒，建立了一個抗腫瘤藥物篩選平臺，并在分子及細胞水平上證明了報告基因體系可以響應藥物對細胞的影響，從而實現對抗腫瘤藥物的篩選。在之后的研究工作中，我們考慮將這些報告基因質粒構建為穩定的細胞株，建立完整的活細胞示蹤體系，從而為研究抗腫瘤藥物提供更好的技術體系。