油莎豆丙酮酸激酶基因的鑒定及其在塊莖發芽和幼苗形態建成時期的表達分析

史先飛，高 宇，黃旭升，周雅莉，劉寶玲，李潤植，薛金愛

（山西農業大學農學院/分子農業與生物能源研究所，晉中 030801）

光合作用是植物生命周期中有機物質碳骨架和大部分生物量的最初來源［1］。光合作用所固定的碳大多分配在可溶性糖和淀粉中，其參與植物體內的代謝，在光暗周期的循環中被消耗的同時也可以重新合成積累。植物油脂作為重要的儲能物質，其生物合成通常會消耗光合作用產生的糖和積累的淀粉［2］。淀粉/糖類和油脂生物合成途徑之間的碳源競爭和平衡制約著植物器官形態的建成和生長發育，以及貯藏物的積累［3］。生物有機體普遍存在的糖酵解（glycolysis）能將葡萄糖分解成丙酮酸，并伴隨著能量的產生［4］，在整體代謝網絡中處于核心位置，通過底物、產物和中間物與其他代謝途徑相聯系。例如，糖酵解途徑的終產物丙酮酸就可參與三羧酸循環、氨基酸代謝和脂質代謝等數百個生化反應［5］。

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）不可逆地催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）生成丙酮酸（pyruvate，Pyr），同時產生ATP［5］，是調控糖酵解途徑中生成丙酮酸的關鍵性限速酶。高等植物PK生化特性復雜，不同PK的基因表達模式和酶活性調控機制不同，所參與的物質代謝等生物學過程亦有差異。依據亞細胞定位，PK可分為細胞質丙酮酸激酶（cytosolic pyruvate kinase，PKc）和質體丙酮酸激酶（plastidial pyruvate kinase，PKp）兩類［6］。這兩類同工酶在物理特性、免疫學和動力學以及調控上有明顯差異，分別行使不同的功能［6］。PKc主要參與植物線粒體的呼吸代謝，對碳源流向和源庫關系有重要的影響和作用。PKp則參與營養器官或種子質體中油脂等儲藏物質的生物合成［7］。擬南芥（Arabidopsisthaliana）中已鑒定出10個AtPKc和3個AtPKp。擬南芥Atpkp1突變體種子中油脂含量減少，種子發芽延遲［8］。外源添加蔗糖可部分恢復Atpkp1突變體幼苗的發育［9］，PKp可將糖源轉化為不同代謝途徑的前體物質。馬鈴薯塊莖中鑒定出5個StPKc和4個StPKp基因。在馬鈴薯塊莖中，StPKc沉默導致PKc酶活性降低，進而引起丙酮酸和三羧酸循環中一些有機酸含量降低，碳源從糖酵解轉向淀粉合成［10］。枇杷（Eriobotryajaponica）PKc的基因EjPK在枇杷發育果實糖積累階段高表達，此階段的丙酮酸含量增加，烯醇式丙酮酸的含量降低［11］。水稻（OryzasativaL.）細胞質Ospk1突變體的穗中蔗糖含量降低了84%，OsPK1的缺失嚴重影響了單糖的代謝和糖轉運［12］。定位于葉綠體的Ospk2缺失突變體水稻的胚乳中淀粉含量顯著下降，酶活性的降低導致多種代謝途徑紊亂，發芽過程中油脂的含量增加導致了發芽率降低［13］。

油莎豆（CyperusesculentusL.）主要以塊莖繁殖，塊莖組織可積累大量的碳水化合物和蛋白質，淀粉含量占干重的40%，糖含量為20%，蛋白質含量為9%［14-15］。與馬鈴薯（SolanumtuberosumL.）、甘薯（Dioscoreaesculenta）等的塊莖、塊根的儲能作物不同，油莎豆塊莖可積累大量油脂，高達塊莖干重的30%，油莎豆油的脂肪酸組成與橄欖（Canarium album）、牛油果（Perseaamericana）、榛果（Corylus heterophylla）類似，油酸含量高達60%～75%［16］，是現在唯一已知的地下塊莖組織儲藏大量油脂的植物。因此，油莎豆被認為是研究非種子器官或營養器官中碳代謝及調控機制的一個理想模型。塊莖發芽和幼苗形態建成是一個復雜的生理過程，包括碳水化合物的代謝，核酸、蛋白質的合成及各種信號轉導［17］。在該生物學過程中，糖酵解、三羧酸循環和戊糖磷酸途徑可消耗塊莖貯藏的營養物質并提供能量［18］。然而，在油莎豆塊莖發芽和幼苗建成的過程中，這些代謝途徑及其碳通量的協同調控機制還不清楚。為此，本研究以PK為靶標，基于油莎豆塊莖轉錄組數據鑒定油莎豆CePK基因，使用生物信息學工具分析這些CePK的蛋白特征和進化關系，定量檢測油莎豆CePK基因在塊莖發芽及幼苗建成過程的時空表達譜，以期獲得解析油莎豆塊莖發芽及幼苗建成過程中碳源消耗及再利用分子機制的新知識。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種質材料油莎豆由山西農業大學分子農業與生物能源研究所提供。挑選飽滿、發芽點完整的油莎豆塊莖做發芽預處理后，使用Hoagland營養液于人工氣候箱中培養，溫度為28℃，光暗周期為16 h/8 h。取油莎豆發芽和幼苗建成階段4個時期的塊莖樣品：吸脹后的油莎豆塊莖為T0階段；吸脹3 d后，塊莖萌發白色幼芽為T1階段；吸脹9 d后，白色幼芽轉變為綠色，長出白色的幼根和根狀莖，為T2階段；吸脹23 d后，莖和葉伸長，根系發達，為T3階段。液氮速凍后-80℃下儲存。使用TransZol Plant（TRANS）試劑盒提取RNA，使用GenStarStarScriptII cDNA試劑盒反轉錄獲得cDNA，于-20℃下保存。

1.2 油莎豆CePK基因序列的鑒定

基于本研究組的油莎豆發育塊莖的轉錄組數據，以擬南芥AtPK蛋白序列為索引，檢索獲得油莎豆CePK蛋白序列。所有AtPK蛋白序列均下載自TAIR（https://www.arabidopsis.org/）網站。于Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）和 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網站獲取水稻、高粱（Sorghumbicolor）、馬鈴薯、煙草（Nicotianataba-cumL.）和大豆（Glycinemax）的PK蛋白序列，并對其重新命名和編號。使用MEGA_11.0軟件的Phylogeny工具，選擇鄰接法（neighbor-joining，N-J）構建系統發育樹，設置自舉檢驗值為1 000。使用Xfam（http://pfam.xfam.org/）在線工具分析CePK蛋白序列的保守結構域，通過GeneDoc軟件進行蛋白多序列比對分析。利用TBtools軟件和MEME（https://meme-suite.org/meme/）在線工具，分析CePK家族的保守基序（Motif）。

1.3 油莎豆CePK蛋白的理化性質及高級結構分析

通過ExPASy（https://www.expasy.org/）在線工具預測CePK蛋白的相對分子質量、等電點（isoelectric point，pI）和親水系數等理化性質。使用TMHMM_2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）在線工具預測CePK蛋白的跨膜結構。使用Cell-PLoc_2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線工具預測CePK蛋白的亞細胞定位。使用SOPMA（http://www.prabi.fr/）和SWISS-MODLE（https://swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具預測CePK蛋白的高級結構。

1.4 油莎豆CePK基因在塊莖發芽和幼苗建成不同時期的表達譜分析

使用Premier 6軟件設計CePK基因的特異性定量引物，以18S rRNA作為內參基因（表1）。應用實時熒光定量PCR檢測CePK基因的相對表達量，試劑盒使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），反應程序為95℃ 2 min、95℃15 s、60℃ 30 s，40個循環。使用SPSS和GraphPad 9軟件處理相對表達量并繪制柱形圖。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結果與分析

2.1 油莎豆CePK基因的篩選及鑒定

基于油莎豆發育塊莖的轉錄組數據，以AtPK蛋白序列為索引進行本地BLAST，結果共篩選鑒定出7條油莎豆CePK蛋白序列。與已鑒定和注釋的PK蛋白序列構建系統進化樹（圖1），結果顯示，來自油莎豆的7個CePK蛋白包含3個質體型和4個細胞質型。依據同源進化關系可知，3個質體型又分別屬于Plastidial-α I、Plastidial-β I、Plastidial-β II，4個細胞質型分別屬于Cytosolic-I和Cytosolic-II。將這7條油莎豆CePK蛋白序列分別命名為CePKpα、CePKpβ1～2和CePKc1～4。所有CePK蛋白均具有PK蛋白典型的PK和PK_C結構域（圖2），CePKp和CePKc蛋白的保守結構域之間不完全相同。同類型的CePK蛋白結構域之間無明顯差異。

圖1 油莎豆CePK蛋白的系統進化樹和保守結構域Fig.1 Phylogenetic and conserved domains of CePK proteins in C. esculentus

2.2 CePK蛋白的基序組成

基于蛋白序列的保守基序分析，這7條CePK蛋白序列共鑒定出15個保守Motif，分別以不同顏色表示（圖3）。質體型和細胞質型的CePK之間的差別較大，同類型CePK蛋白保守基序的數量和種類更相似。Motif 14和Motif 15只出現在質體型CePK蛋白序列中，β型中出現的Motif 13和Motif 15在α型中并未出現。Motif 9和Motif 12僅出現在細胞質型的CePK蛋白序列中，CePKc3較其他細胞質型序列缺少Motif 13。這些蛋白序列保守結構上的差異，預示著CePK基因可能在塊莖中響應不同的代謝途徑。

圖3 CePK蛋白的保守基序Fig.3 The conserved motifs in CePK proteins

2.3 CePK蛋白的理化性質

基于以上序列的鑒定分析，本研究進一步解析了這些蛋白的性質和功能（表2）。油莎豆質體型和細胞質型CePK蛋白之間的理化性質差異較大，同類型間性質接近。3個CePKp預測的亞細胞定位均位于葉綠體，4個CePKc預測的亞細胞定位均位于細胞質，這與之前的預測一致。CePKp編碼的蛋白的序列長度較CePKc長，相對分子質量大。CePKc均為穩定的疏水蛋白；CePKp中β2為穩定型蛋白，α和β1為不穩定蛋白，3個CePKp均為親水性蛋白。7個CePK蛋白均不含跨膜結構。pI差異較大，最小值為4.99，最大值為8.47，均屬PKc型。CePKp和CePKc蛋白理化性質上的差異預示著這些蛋白可能發揮不同的功能，參與不同的代謝途徑。

表2 油莎豆CePK蛋白理化性質分析Tab.2 Prediction of physical and chemical properties of CePK proteins in C.esculentus

2.4 CePK蛋白的高級結構

為進一步解析CePK蛋白的結構，本研究對CePK的高級結構進行了建模。CePK蛋白的二級結構預測均包含α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈（表3）。這7個CePK蛋白的二級結構相似，其中β-轉角所占比重最低，為7.11%～8.79%；α-螺旋和無規則卷曲分別為33.79%～39.28%和32.62%～41.42%，兩者所占比重較為接近；延伸鏈所占比重為16.26%～20.12%。分別以1pkm.1和6ksh.1蛋白為模板，對3個CePKp和4個CePKc蛋白進行三級結構建模（圖4）。CePKpα、CePKpβ1、CePKpβ2與模板1pkm.1的相似性分別為33.40%、36.42%、37.68%；CePKc1、CePKc3、CePKc2、CePKc4與模板6ksh.1的相似性分別為 34.29%、35.77%、49.59%、48.15%。三級結構預測結果顯示，CePK均以復合體同源四聚體的形式存在。

圖4 CePK蛋白的三級結構Fig.4 The tertiary structure of CePK proteins

表3 CePK蛋白的二級結構Tab.3 Secondary structure of CePK proteins Unit: %

2.5 CePK基因在油莎豆塊莖發芽和幼苗建成時期的表達模式

油莎豆塊莖發芽和幼苗建成時期伴隨有大量的生理代謝活動。為了鑒定CePK基因在建苗過程中的功能和作用，本研究檢測了不同時期塊莖中CePK基因的表達譜。取油莎豆發芽和幼苗建成階段這4個時期的塊莖，在這4個階段中共檢測到5條CePK基因的表達變化（圖5）。CePK基因存在3種不同的表達變化趨勢：CePKpα、CePKc3和CePKc4基因先降低后升高再降低；CePKpβ1基因持續降低；CePKc2先降低后升高。2種質體型的CePKp基因在T3階段都不表達，但是這兩個基因的變化趨勢不同，CePKpα基因的表達水平變化更加顯著。3種細胞質型的CePKc基因存在2種表達模式，總體表達水平都是降低的。CePKc2基因與CePKc3和CePKc4基因的表達模式不同，表達水平降低程度更大。不同的CePK基因表達模式具有一定的時空特異性，預示著其可能差異化調控塊莖發芽和幼苗建成期營養物質的代謝途徑。

圖5 CePK基因在油莎豆發芽和幼苗期塊莖的表達模式Fig.5 Expression profiles of CePK genes at germination period and seedling stages in C.esculentus tuber

3 討論

PK是糖酵解途徑的關鍵性限速酶之一，不可逆地催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，參與調控生長發育和物質代謝等重要生理過程［5］。PK的基因在多種動物中已經被鑒定和克隆，其生物學功能也得到了廣泛的研究［19］。然而，高等植物PK的基因數量更多，具有更加復雜的生化特性，而有關植物PK的基因的研究尚不全面。油莎豆的塊莖可以積累大量的碳水化合物，尤其是其營養器官中積累了大量的油脂，且富含油酸，可作為一種新型的糧油作物。解析其碳流通和再分配具有重要的研究意義。

本文基于轉錄組測序數據，首次對油莎豆CePK基因進行挖掘，共鑒定出7個編碼CePK蛋白的CePK基因。以擬南芥AtPK［20］、水稻OsPK［13］、高粱 SbPK、馬鈴薯StPK［10］、煙草NtPK［7］和大豆GmPK［21］為模板序列，依據系統進化樹以及PK和PK_C保守結構域的差異對油莎豆CePK蛋白進行命名和分類，分為3種質體型的PK（CePKpα、CePKpβ1～2）和4種細胞質型的PK（CePKc1～4）（圖1、2）。所有類型的CePK蛋白均具有典型的PK和PK_C保守結構域，PKp和PKc保守Motif之間存在差異（圖3），且同類型CePK蛋白的理化性質和高級結構更為相似。在幾乎所有的生物體內PK都可以同源四聚體的形式存在，然而不同植物或不同組織的PK復合體具有相當大的多樣性［22］。三級結構預測油莎豆PK均以同源四聚體的形式存在（圖4），與之前在水稻［23］、馬鈴薯［10］、枇杷［11］中的報道一致，與蓖麻（RicinuscommunisL.）中分離的異源四聚體和異源六聚體存在差異［24-25］。物種進化上的差異可能預示著這些酶功能上存在差異。

成熟塊莖中碳水化合物和蛋白質等貯藏物質的降解及再利用決定著塊莖的正常發芽，以及幼苗的形態建成和生長發育。然而，油莎豆塊莖發芽過程中貯藏物質降解及調控分子機制還未見詳盡報道。PK是調控糖酵解途徑的關鍵性限速酶，其催化底物磷酸烯醇式丙酮酸和產物丙酮酸是細胞內物質合成及代謝的重要前體，參與植物體的多種代謝途徑，如乙醛酸循環［26］、三羧酸循環［27］過程和蛋白、脂肪酸［5］的合成等。PK在塊莖發芽和幼苗建成代謝過程中有著重要的調節作用。本研究檢測到5個CePK基因在塊莖發芽和幼苗建成階段（T0～T3）的油莎豆塊莖中表達，不同的CePK基因呈現了不同的表達模式（圖5）。3個CePKc基因在幼苗階段（T3）的塊莖中表達，2個CePKp基因均不在T3階段表達，預示著這兩種類型的CePK基因可能參與不同營養物質的代謝途徑。在種子萌發和塊莖發芽的過程中，淀粉、脂肪酸降解，可溶性糖的含量會隨之增加，提供必要的能量以供種子萌發和幼苗的形成［28-29］。馬鈴薯塊莖發芽變綠過程中淀粉大量水解，可溶性糖含量增加以供應塊莖萌芽以及芽的初期生長［30］。油莎豆CePKc基因的表達水平較高，T0階段均呈現出高的表達水平，之后大幅降低后又增加，這與油料作物萌發中可溶性糖含量變化的趨勢一致［31］，可推測這種細胞質型的PK極有可能參與淀粉與糖的生物合成途徑。CePKp基因的表達水平較低，CePKpβ1基因呈現持續降低的趨勢且在T3階段不表達，CePKpα基因在T2幼苗變綠的階段暫時升高且在T3階段不表達。在淀粉和油脂等儲藏物質分解的過程中，CePKp基因呈現出較低的表達水平，質體型PK的基因已被證實與這些儲藏物質的合成相關，可推測這些來自于油莎豆的CePKp極有可能也與油脂和淀粉的生物合成相關。這些CePK基因可以應用于后續的功能分析，以期精準解析油莎豆塊莖貯藏營養物質的降解和再利用及其調控碳流通和再分配的分子機制，拓展有關營養器官繁育作物發芽和幼苗形態建成階段生物學過程精準調控網絡的認知。