根際細菌群落結構與裝配對煙草根系生長性狀的影響

侯建林，李宏光*，肖艷松，職齊琦 ，胡 琦，許淘莎，于法輝，靳志麗，周向平

（1.湖南省煙草公司郴州市公司，郴州 423000；2.中南大學資源加工與生物工程學院，長沙 410083；3.湖南省煙草公司永州市公司，永州 425000）

植物根際微生物具有高度多樣性［1］，在生物地球化學循環中扮演了關鍵的生態角色［2］。根際微生物的群落組成和功能結構與能量流動和碳氮元素循環密切相關，部分功能微生物還可分泌植物生長因子，促進植物生長。例如，根際中存在多種可分泌植物生長素吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）的微生物，包括根瘤菌（Rhizobium）［3］、芽孢桿菌（Bacillus）和乳酸桿菌（Lactobacillus）［4］等。此外，還有大量微生物可溶解根際礦物質并釋放營養元素，如鋅［5-6］、磷［7-9］、鉀［10-11］等。然而，目前大部分關于促進植物生長的微生物研究主要聚焦于單菌的代謝功能上，而微生物間協同作用的研究較少。解析根際微生物功能團及其協同作用機制，不但可深入剖析根際微生物在根際中扮演的生態角色，還可為開發微生物菌肥以促進植物生長發育提供理論依據。

根際環境總體上塑造了微生物的群落組成［12］、多樣性［13］、相互作用和發育裝配模式［14］及功能結構［15-16］，而微生物依其代謝活性營造了適宜生存的微環境［17-18］，從而改善了植物的根際環境，提高了根系性狀。一方面，土壤微生物可分泌胞外多聚物形成生物膜，以提高對環境擾動的抗性、群落多樣性和代謝活性［18］。土壤微生物也會分泌鐵載體，以促進環境鐵離子的富集，提高微生物對重金屬的抗性［19］，強化植物對鐵離子的吸收效率［20］。這些結果表明，微生物可以依靠其代謝功能顯著影響土壤環境。另一方面，土壤微生物群落的分子生態網絡會隨著植物生長逐漸變得復雜，模塊性及模塊數量升高［21］，這與構建氮降解等微生物功能團的形成密切相關［22］，暗示微生物可在短期內快速參與根際土壤環境的形成。盡管大量研究表明了微生物群落結構特征在植物根系性狀的改變中發揮著關鍵作用，強調了作物生長過程中微生物種群組成與根系性狀差異的關聯性，但目前對根際微生物的組成、共現網絡、關鍵功能物種和發育裝配及其對根系特征演變的作用仍知之甚少。

本文以發達根系（well-developed root system，WDR）與不發達根系（undeveloped root system，UDR）的根際系統為研究對象，利用16S rRNA高通量測序技術，研究農田根際微生物的群落組成，探究根系性狀的差異與微生物群落組成的多樣性、結構功能、分子生態網絡拓撲性質及發育裝配模式的關聯性，用于解決以下問題：1）根際細菌群落在WDR與UDR的條件下是否存在顯著不同？2）是否存在特別重要的微生物類群在裝配過程中發揮關鍵作用？

1 材料與方法

1.1 試驗設計

樣本采集自湖南一塊長期定位的試驗煙田（經度 ：112°06' N，緯度 ：27°59' E），分別采集成熟期根系WDR和UDR的煙草（Nicotiana tabacum）根際土壤，每類各10份。采集過程中將整株植物連根拔起，去除根系松散附著的土壤，用刷子刷取根部黏附的剩余土壤即為根際土壤，標記保存后用于后續細菌群落分析和高通量測序分析。根際土壤的理化特性如表1所示，有效鉀含量的平均值為787.58 mg/kg，有效磷含量的平均值為81.68 mg/kg，總氮量的平均值為2 039.20 mg/kg，有機質的含量百分比為4.19%，pH平均值為5.97。

表1 根際土壤的理化特性分析Tab.1 Soil physicochemical properties

1.2 DNA提取和擴增子測序

利用強力根際DNA提取試劑盒（MoBio，SanDiego，CA，USA）按說明書從1.0 g根際樣品中提取DNA。利用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4區。PCR擴增反應體系含有1.0 μL DNA模板（～25 ng DNA）、12.5 μL Taq Master Mix（Vazyme，Piscataway，NJ，USA）、0.5 μL引物，DNase-free去離子水調節體系體積至25.0 μL。PCR擴增程序設置如下：98℃ 30 s；98℃ 10 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，32次循環；72℃ 10 min；4℃保存。利用Gel Extraction Kit（OMEGA Bio-Tek Inc.，Doraville，GA，United States）純化PCR產物。利用Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，USA）對其定量，等摩爾濃度混庫后，在Illumina NovaSeq PE250平臺上進行高通量測序（LC-Bio Technology Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang Province，China），得到已去接頭FASTQ格式的原始數據。

1.3 數據處理與分析

使用QIIME 2來處理原始數據，并且去除低質量序列和嵌合體，再生成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）表，進行物種注釋。使用R語言進行所有的計算分析，得到微生物群落Shannon、Pielou等多樣性指數，采用主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）來比較總體微生物群落結構。采用多重比較方差分析方法計算組間細菌群落的Alpha多樣性差異。利用線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）確定組間各分類水平上具有統計學差異的生物標識。基于Spearman相關性構建分子生態網絡。利用零模型分析細菌群落系統發育裝配。

2 結果與分析

2.1 根際細菌的群落組成和結構

利用16S rRNA基因高通量測序技術分別對UDR和WDR的根際細菌群落進行檢測注釋，結果如圖1所示。在門水平上，UDR和WDR根際細菌群落的優勢菌均主要為Proteobacteria、Acido-bacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi和Patescibacteria，UDR根際細菌群落主要包含26.2%～46.3%的Proteobacteria、14.4%～26.6%的Acidobacteriota、2.6%～16.8%的Bacteroidota、2.1%～10.0%的Chloroflexi和2.1%～13.6%的Patescibacteria，而WDR根際細菌群落主要包含20.9%～32.5%的Proteobacteria、23.6%～34.4%的Acidobacteriota、3.0%～12.0%的Bacteroidota、5.9%～10.3%的Chloroflexi和2.6%～4.6%的Patescibacteria。

圖1 UDR和WDR根際細菌群落的組成Fig.1 Rhizosphere bacterial community composition of UDR and WDR

Alpha多樣性分析結果顯示，WDR根際細菌群落的Observed、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和InvSimpson指數均高于UDR，表明WDR根際細菌群落物種的豐度和多樣性均高于UDR（表2）。

表2 UDR和WDR根際細菌群落的Alpha多樣性分析Tab.2 Alpha diversity analysis of rhizosphere bacterial communities of UDR and WDR

PCoA結果顯示（圖2），WDR和UDR樣本間明顯分開，主坐標軸PCoA1和PCoA2分別解釋了18.0%和14.2%細菌群落結構的差異，解釋度較低，表明根際細菌群落結構是復雜的。

圖2 UDR和WDR根際細菌群落相似性分析Fig.2 Rhizosphere community similarity analysis of UDR and WDR

通過差異性檢驗確定了WDR和UDR之間豐度具有顯著差異的物種（P<0.05）。圖3展示了豐度最高的16個差異物種，其中WDR根際細菌群落的Edaphobaculum、PLTA13、Rhodobacter、Parablastomonas、Noviherbaspirillum、JG36-GS-52、Algoriphagus和Rhodoplanes等屬均顯著低于UDR，而Gallionella和Luteimona等屬則顯著高于UDR。

圖3 UDR和WDR根際細菌群落差異性分析Fig.3 Difference analysis of rhizosphere bacterial community between UDR and WDR

2.2 根際細菌群落的分子生態網絡結構和關鍵微生物

為解析土壤菌群物種間的共存模式，本研究基于隨機矩陣理論構建了UDR和WDR的根際細菌群落的分子生態網絡。如表3所示，相比WDR，UDR根際細菌群落的分子生態網絡的規模（節點，vertex）、連通性（邊，edge）、平均度（average degree）、聚類系數（clustering coefficient）、密度（density）和內聚性（centralization）均增加，表明UDR的分子生態網絡更加復雜；而平均路徑長度（average path length）和網絡直徑（network diameter）減短、網絡正相關連接（positive links）的百分比增加，表明UDR物種間的相互作用增強，特別是合作行為。

表3 UDR和WDR的根際細菌群落的分子生態網絡拓撲性質Tab.3 Topological properties of molecular ecological network of UDR and WDR rhizosphere bacterial communities

網絡結構的改變可能會進一步影響網絡成員角色發生改變。基于它們的模塊內連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi），檢測到UDR的分子生態網絡具有1個模塊中心點［（moudule hubs；Zi>2.5且Pi<0.62），主要為Nitrospirota］、43個連接節點［（connectors；Zi<2.5且Pi>0.62），主要為Acidobacteriota和Proteobacteria］以及3個網絡中心點［（Network hubs；Zi>2.5且Pi>0.62），主要為Proteobacteria和Gemmatimonadota］；而WDR分子生態網絡有2個模塊中心點（主要為Acidobacteriota和Chloroflexi），52個連接節點（主要為Acidobacteriota和Proteobacteria）以及3個網絡中心點（主要為Acidobacteriota、Nitrospirota和Proteobacteria）。這些都是在塑造網絡結構中發揮關鍵作用的節點。相比UDR，WDR的關鍵節點數較多，且連接節點均主要屬于Acidobacteriota和Proteobacteria。

網絡模塊與細菌群落功能的關聯性預測結果顯示，UDR和WDR的網絡模塊主要與能量流動功能相關。相比UDR，WDR的碳循環相關網絡模塊增加（圖4）。

圖4 UDR和WRD根際細菌群落網絡模塊的生物地球化學作用Fig.4 Biogeochemical effects of rhizosphere bacterial community network modules in UDR and WRD

2.3 根際細菌群落的發育裝配

為了研究群落系統發育組裝過程中確定性和隨機性作用對根系發育情況的影響，本研究計算了凈譜系親緣關系指數（net related index，NRI）和最近種間親緣關系指數（nearest taxon index，NTI）。相比UDR，WDR的NRI和NTI指數較高，表明WDR根際微生物群落裝配更趨向于發育聚集（圖5）。

圖5 UDR和WDR根際細菌群落NRI和NTI指數Fig.5 NRI and NTI of rhizosphere community in UDR and WDR

圖6進一步表明，WDR和UDR的betaNRI和betaNTI指數存在顯著差異（P<0.000 1），且WDR的betaNRI指數小于-2，顯著大于UDR，表明環境過濾在WDR的群落裝配中發揮了更重要的作用。WDR根際細菌群落裝配更趨向于發育聚集，且環境過濾在其中發揮了更重要的作用。

圖6 UDR和WDR根際細菌群落betaNRI和betaNTI指數Fig.6 Rhizosphere community betaNRI and betaNTI index of UDR and WDR

3 討論

根系微生物在煙草生長發育過程中有著重要的作用，其群落結構和發育裝配與根系是否發達密切相關。Shi等［21］的研究結果表明，燕麥的根系發育過程與微生物群落密切相關，隨著根系的發育，根際微生物的相互作用網絡變得更加復雜和模塊化；同時，隨著根系的發育，根際微生物群落多樣性降低，出現發育聚集的現象。本研究結果指出，WDR與UDR煙草的根際細菌群落組成存在顯著差異。不同的是，WDR的根際細菌物種的豐富度和多樣性均高于UDR，表明微生物群落結構對煙草根系發育產生了直接影響。與UDR相比，WDR的根際細菌群落中Gallionella和Luteimona等屬的豐度顯著較高，而Edaphobaculum、PLTA13和Rhodobacter等屬的豐度則顯著較低。Gallionella是一類鐵氧化菌，是植物根系環境中Fe（II）的關鍵參與者。有研究指出，Gallionella相關的FeOB能參與并影響植物培育土壤中Fe（II）的氧化過程，促進根系鐵元素的吸收［22］。而Luteimona是一類常見的植物促生菌，能通過影響植物根系的羧酸和胺的含量提高植物的抗逆生長能力［23］。

土壤微生物群落的相互作用是維持根際生態系統功能和結構穩定的關鍵［24］，這些相互作用廣泛且復雜。分子生態網絡拓撲性質表明，相比WDR，UDR根際細菌群落的分子生態網絡的規模、連通性、平均度、聚類系數、密度和內聚性增加，而平均路徑長度和網絡直徑減短，表明不發達根系分子生態網絡更加復雜，物種間相互作用更加強烈，且其網絡正相關連接增加，表明UDR的根際細菌物種間相互趨向合作而不是競爭，具有更多正相互作用的復雜的分子生態網絡，在環境變化中更有利于維持系統的穩定［25］，但缺乏對有限資源的競爭以及獨特的環境生態位和空間隔離，可能不利于根際環境的改善和植物的生長。模塊特征基因分析對于揭示高階組織和識別關鍵種群具有重要意義［26］。通過計算節點模塊內連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi）檢測得到WDR分子生態網絡中的關鍵節點主要屬于Chloroflexi和Proteobacteria。大量研究表明，Proteobacteria在微生物氮、磷循環中發揮著關鍵作用［27］，Chloroflex的豐度對環境pH的變化較為敏感［28］。同時，相比UDR，WDR的碳循環相關網絡模塊增加。這些結果表明，網絡模塊化結構與微生物的特異性功能團形成有密切聯系，深入剖析模塊成員的組成及其相互作用將更有利于認識微生物群落在土壤物質循環的生態角色。

NRI可提供種群深度關聯程度的重要信息，而NTI則能進行更精細的系統發育檢查。結果表明，UDR和WDR的NRI/NTI值均大于0，表明兩種情況下，微生物都呈現聚集。相比之下，后者的NRI/NTI指數大于前者，表明WDR的根際微生物發育更聚集。研究表明，植物與根系微生物的相互作用是其提高環境適應性和抗逆性力的重要因素，相反，環境因素也會影響微生物的群落組裝［29］。可以初步判斷，微生物聚集差異是導致植物根系發育差異的重要原因。然而，根系的發育情況和微生物群落裝配的直接關系還有待進一步驗證。

我們的研究結果表明了作物根系生長發育情況與微生物的群落組成、結構功能、網絡變化和發育裝配存在顯著的關系。WDR根際系統的微生物群落的多樣性高于UDR根際系統；WDR的根際系統Gallionella和Luteimona的豐度高于UDR的根際系統，推測其可能參與了根系的鐵元素吸收和抗逆性的形成，從而促進了植物根系的生長。同時，UDR系統的分子生態網絡較為復雜，物種間相互作用較強，特別是合作行為，而WDR系統的關鍵節點數和碳循環相關網絡模塊與UDR相比增加，網絡結構變化似乎與微生物群落的功能結構和生態系統功能過程密切相關。此外，WDR的根際系統中，微生物群落系統發育更趨于發育聚集，表明微生物群落受環境選擇的影響較大，暗示了根系生長過程中，微生物群落的系統發育是保守的。這些結果說明了微生物群落的關鍵物種可改善植物根系生長發育，為開發微生物菌肥調控根際微生物群落組裝，從而促進植物根系生長提供了理論依據。