電化學(xué)振蕩反應(yīng)用于中藥鑒定的反應(yīng)過程及機(jī)理研究

李繼睿，禹練英，徐祥斌，李忠英，王織云

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲 412004）

中醫(yī)藥是我國(guó)重要的寶貴財(cái)富，經(jīng)過幾千年的實(shí)踐證明療效是顯著的[1-2]，確立了自身在世界四大傳統(tǒng)醫(yī)藥體系中獨(dú)特的地位和理論體系。到目前為止，已經(jīng)應(yīng)用過或正在應(yīng)用中醫(yī)藥的國(guó)家有近百個(gè)，且有80%以上的人使用過天然動(dòng)植物、礦物等做藥物，還使用這些天然動(dòng)植物和礦物加工的提取物來生產(chǎn)藥物——這些一般被認(rèn)為是西醫(yī)西藥的范疇。

我國(guó)是中醫(yī)中藥傳統(tǒng)大國(guó)，但是在國(guó)際中藥成藥市場(chǎng)中卻只占據(jù)了不足12%的市場(chǎng)份額，并主要以天然原料藥物輸出為主。出現(xiàn)這種情況的原因，主要是對(duì)中藥的特性研究不夠透徹，對(duì)中藥的成分、藥性、病理學(xué)、藥理學(xué)的研究不夠深入，導(dǎo)致對(duì)中藥持懷疑態(tài)度的人和觀點(diǎn)時(shí)有涌現(xiàn)[3]。因此，建立中藥質(zhì)量監(jiān)控體系、統(tǒng)一中藥的含量和成分、建立起科學(xué)高效的質(zhì)量保證體系，成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化過程中一項(xiàng)正待改善的迫切要求。

1 電化學(xué)振蕩的應(yīng)用現(xiàn)狀

在電化學(xué)振蕩的研究歷史中，有很多經(jīng)典的例子，比如：BZ反應(yīng)、六角雪花、伯納德花紋、糖酵解 等[4]?；瘜W(xué)振蕩應(yīng)用于分析化學(xué)始于20世紀(jì)70年代末，1978年，Tikhonova發(fā)表了一篇化學(xué)振蕩在分析化學(xué)方面應(yīng)用的文章，該文章報(bào)道了微量O8RuS2對(duì)B-Z反應(yīng)的影響，結(jié)論表明，其變化與O8RuS2的質(zhì)量濃度（7~330mg/L）成正比例關(guān)系，并利用這個(gè)公式測(cè)定得到釕的含量，Dolores Perez Bendito等在1995年利 用APP（Analyte Pulse Perturbation Technique）對(duì)被測(cè)定物質(zhì)對(duì)化學(xué)振蕩體系的脈沖擾動(dòng)影響進(jìn)行了分析測(cè)定[5-6]。其中應(yīng)用最廣的是利用化學(xué)振蕩技術(shù)測(cè)定NADP等生物活性物質(zhì)。

BZ反應(yīng)應(yīng)用于分析化學(xué)方面也比較廣，主要是測(cè)定無機(jī)陰離子和金屬離子，測(cè)定的氣體主要有CO、Cl2、NO等[7]，測(cè)定的陰離子有Cl-、F-、I-、S2O32-、金屬絡(luò)合陰離子等[8]，測(cè)定的金屬離子有Fe3+、Mn2+、Ag+、Tl3+、Ru3+、Hg2+等。

另外，BZ反應(yīng)在有機(jī)物的測(cè)定方面使用也比較多，尤其是在藥物分析方面應(yīng)用比較廣泛。通過現(xiàn)有文獻(xiàn)分析，在測(cè)定香子蘭醛、苯酚、沒食子酸、維生素B1、維生素B2、二苯胺磺酸鈉、纈氨酸、咖啡因、間苯二酚、維生素B6、維生素C、氫醌、利福平、谷胱甘肽時(shí)，這些被測(cè)有機(jī)物多為藥物，分析化學(xué)家已經(jīng)試圖將生命體內(nèi)的振蕩現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行研 究[1-2]，還有使用BZ反應(yīng)測(cè)定患者的血清和尿液獲得了較好的研究成果。另外，在味覺模擬和味覺測(cè)定這一塊，使用BZ方法也更接近于實(shí)際情況。

雖然長(zhǎng)期以來對(duì)化學(xué)振蕩應(yīng)用研究得較多，但關(guān)于化學(xué)振蕩反應(yīng)過程和機(jī)理的研究較少，特別是對(duì)于化學(xué)振蕩反應(yīng)在中藥鑒定中的應(yīng)用機(jī)理研究很少。

2 中藥質(zhì)量控制現(xiàn)狀

中藥及中成藥真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)科學(xué)方法的建立已成為分析化學(xué)家具有挑戰(zhàn)性的工作和課題。用于中藥這一黑色或灰色復(fù)雜體系化學(xué)成分群集表征的中藥指紋圖譜一詞應(yīng)運(yùn)而生，而且指紋圖譜在中藥及中成藥真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)與監(jiān)控方面的重要作用已成為大家的共識(shí)[11]。

目前，已經(jīng)被文獻(xiàn)證實(shí)的中藥材鑒別方法以及分析方法主要有：①色譜指紋圖譜法聯(lián)用技術(shù)，這是一種應(yīng)用非常廣泛的方法，可以進(jìn)行定性測(cè)定，也能進(jìn)行定量測(cè)定。不過這種方法的樣品處理過程較為繁瑣，同時(shí)在樣品處理過程中極易混入其他雜質(zhì)，還有就是這種方法處理的試樣僅限于重要化學(xué)成分信息。②分子標(biāo)記法，重現(xiàn)性好，可靠性也強(qiáng)，具有一定的專屬性。不過其缺點(diǎn)是對(duì)操作要求高，設(shè)備昂貴，同時(shí)也需要對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記。③光譜指紋圖譜法，這種方法雖然適用范圍有限，但是能對(duì)中藥材的部分結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行解讀和分析。

在這三種方法中，中藥及中成藥色譜指紋圖譜的研究和應(yīng)用最為廣泛和深入，已成為目前國(guó)際公認(rèn)的評(píng)價(jià)和控制中藥或天然藥物質(zhì)量最有效的方法和技術(shù)手段。由于中藥成分復(fù)雜且部分成分的含量會(huì)隨著產(chǎn)地、收取季節(jié)、選取部位等區(qū)別而不同，另外，對(duì)于中藥中的天然有效成分的測(cè)定尚不完全清晰。藥材中還存在很多未知成分，使得色譜指紋圖譜存在不可忽視的局限性，如液相色譜僅適用于真溶液體系；氣相色譜僅適用于中藥中揮發(fā)性成分分析；色譜指紋圖譜因其定性和定量參數(shù)一般只有保留值和峰強(qiáng)度，且色譜峰形缺少變化，因而其特征性、直觀性不強(qiáng)，在多數(shù)情況下須根據(jù)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法處理后的結(jié)果來鑒別和評(píng)價(jià)中藥，因而費(fèi)時(shí)，一般只有掌握較強(qiáng)相關(guān)專業(yè)技術(shù)知識(shí)的分析人員才能做出相對(duì)準(zhǔn)確的分析；色譜技術(shù)不能直接用于占絕大多數(shù)中藥成藥中“膏、湯、丸、散”劑型和固體原藥材的指紋圖譜測(cè)定，測(cè)定前必須對(duì)其天然成分進(jìn)行提取、分離等預(yù)處理，因而成分損失，繁瑣、費(fèi)事、操作流程長(zhǎng)，試劑消耗量大，且分析費(fèi)用高，不僅會(huì)引入雜質(zhì)，而且提取的部分已不能代表中藥的天然成分的全部成分，其指紋圖譜實(shí)際上只是中藥部分化學(xué)成分的信息集合等等。故嚴(yán)格說來，色譜指紋圖譜作為中藥復(fù)雜體系所有成分的群集表征，僅適用于中藥注射液和口服等真溶液。因此，對(duì)于無須分離提純等預(yù)處理過程，就能適用于各種類型的物相和劑型的中藥中所有化學(xué)成分群集表征的指紋圖譜分析方法的研究，已成為擺在分析化學(xué)家面前的首要任務(wù)。電化學(xué)振蕩指紋圖譜應(yīng)運(yùn)而生。電化學(xué)振蕩指紋圖譜具有分析無需繁瑣的預(yù)處理，適應(yīng)所有中藥體系，圖譜信息含量大，特征值明顯，重現(xiàn)性好，檢測(cè)費(fèi)用低廉等特點(diǎn)，具有非常好的應(yīng)用前景。

本文旨在通過對(duì)電化學(xué)振蕩反應(yīng)過程和機(jī)理的研究，以達(dá)成對(duì)中藥材更多的化學(xué)成分和藥效信息的分析和了解，并進(jìn)而對(duì)中藥原藥及成藥的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)和鑒別，為中藥材及中藥成藥生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供有效可靠的分析方法。

本文在前人研究工作的基礎(chǔ)上，提出了一種全新的電化學(xué)振蕩指紋圖譜方法，即利用硫酸-丙二酸-溴化鈉-硫酸鈰銨-溴酸鈉振蕩反應(yīng)體系，通過實(shí)驗(yàn)摸索出了該振蕩反應(yīng)體系的最佳組成和測(cè)定的參數(shù)條件，該方法在中藥材及其制品的鑒別和分析方面，具有良好的可表征特異性和重現(xiàn)性。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 實(shí)驗(yàn)儀器

超級(jí)恒溫水?。⊿YC-15型，南京桑力電子設(shè)備廠），振蕩實(shí)驗(yàn)裝置（ZD-BZ型，南京桑力電子設(shè)備廠），雙液接飽和甘汞電極（271型雙鹽橋參比電極）金屬鉑電極（213-01型，上海康寧電光技術(shù)有限公司），數(shù)據(jù)采集裝置，微量進(jìn)樣器，電子天平。實(shí)驗(yàn)裝置見圖1。

圖1 B-Z振蕩反應(yīng)實(shí)驗(yàn)裝置圖

3.2 實(shí)驗(yàn)樣品與試劑

試劑均為分析純，所有溶液均為蒸餾水配制。葡萄糖：市售

加入試劑：蒸餾水（25mL）、5%硫酸（10mL）、8%丙酮（15mL）、1.67%丙酮（15mL）、10.7%溴酸鈉（3mL）。將上述配置試劑放置37.5℃恒溫槽中。

3.3 實(shí)驗(yàn)操作方法

用電子天平稱取規(guī)定量葡萄糖樣本，依次移取25mL蒸餾水、10mL硫酸、15mL丙酮、硫酸錳15ml，于玻璃夾套反應(yīng)器中混合成 65mL反應(yīng)底液。蓋好帶溫度計(jì)、注射孔和電極的反應(yīng)器，調(diào)節(jié)恒溫水浴溫度為37.5±0.1℃，在快速攪拌下，以鉑電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，記錄電極電位E（mV）與時(shí)間t（s）的振蕩曲線。當(dāng)誘導(dǎo)期趨于結(jié)束，振蕩600s時(shí)，用微量注射器加入3mL溴酸鈉。測(cè)定反應(yīng)體系電位隨時(shí)間的變化，并用計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤并記錄振蕩波形。

4 結(jié)果與討論

4.1 電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)

以對(duì)丙二酸-溴酸鉀-硝酸鈰銨-硫酸的B-Z反應(yīng)體系測(cè)定電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)，有誘導(dǎo)時(shí)間、最高電位、最低電位、振蕩周期、振蕩時(shí)間、最大振幅等，如圖2所示。

圖2 電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)

對(duì)不同產(chǎn)地不同種類的中藥進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見圖3、4，可以看出不同的中藥特征參數(shù)不同，不同產(chǎn)地的同一種中藥特征參數(shù)相似。因此，根據(jù)電化學(xué)振蕩指紋圖譜特征參數(shù)可以對(duì)中藥進(jìn)行鑒別和檢測(cè)。

圖4 不同產(chǎn)地當(dāng)歸的特征圖譜

4.2 當(dāng)歸對(duì)B-Z振蕩反應(yīng)的影響及其在分析檢測(cè)中的應(yīng)用

振蕩反應(yīng)的一大特點(diǎn)是在誘導(dǎo)期后會(huì)呈現(xiàn)穩(wěn)定的周期振蕩波形，在這個(gè)周期內(nèi)，無論是振幅、周期還是電位峰谷值都呈現(xiàn)出一種穩(wěn)定性。如果在這種穩(wěn)定體系中加入當(dāng)歸，那么這種干擾物就會(huì)引起體系的波動(dòng)，從而影響振蕩波，使振蕩波發(fā)生振幅、周期、電位峰谷值等參數(shù)的變化，在對(duì)中藥進(jìn)行分析時(shí)就可以很好地利用這一特點(diǎn)來進(jìn)行分析檢測(cè)工作。

4.2.1 當(dāng)歸對(duì)B-Z振蕩反應(yīng)的影響

0.3×6mo1/L丙二酸溶液，0.15mol/L溴酸鉀溶液，4.00mol硫酸溶液，7.28×10-3mol/L硫酸鈰銨溶液，于37℃條件下記錄數(shù)據(jù)（見圖5）。

圖5 加入不同量的當(dāng)歸時(shí)B-Z振蕩反應(yīng)曲線

由圖5可看出，當(dāng)歸對(duì)振蕩反應(yīng)有影響，且隨著當(dāng)歸加入量的加大其影響增大。當(dāng)歸對(duì)振蕩反應(yīng)的影響需在較高的濃度范圍（通常在當(dāng)歸加入量大于5mg/100mL）時(shí)才有明顯現(xiàn)象，振蕩圖像的峰高值在加入當(dāng)歸后會(huì)下降，并與加入濃度成良好的線性關(guān)系。振蕩周期也會(huì)有所延長(zhǎng)，但與加入量關(guān)系不大，都會(huì)延長(zhǎng)5~10s；振幅亦有減小，加入量大時(shí)明顯。

4.2.2 B-Z振蕩反應(yīng)峰值電壓與當(dāng)歸加入量的關(guān)系（見圖6）

圖6 B-Z振蕩反應(yīng)峰值電壓與當(dāng)歸加入量的關(guān)系

5 結(jié)論

研究結(jié)果表明，B-Z振蕩反應(yīng)與溫度、反應(yīng)體系濃度有關(guān)，且當(dāng)歸對(duì)B-Z 振蕩反應(yīng)有影響，且其影響大小與當(dāng)歸加入量有線性相關(guān)性，可以利用這種相關(guān)性進(jìn)行分析檢測(cè)，從而建立了一種新的分析檢測(cè)方法。