溫針灸聯合中藥對類風濕關節炎患者血清 miR-335-5p和miR-141表達的影響

林廣清,鄧玲琳,彭葉

(1.廣東省第二中醫院,廣州 510095;2.廣州中醫藥大學,廣州 510405)

類風濕關節炎為自身免疫結蹄組織病,在生活中較為常見,晨僵、小關節腫脹與疼痛是主要表現,治療不及時易導致關節畸形與殘廢,使患者的正常生活受到影響[1]。類風濕關節炎發生時易伴隨慢性疼痛與關節骨質受損,且易反復發作,給患者帶來較大壓力[2]。隨著類風濕關節炎的發病數升高,尋找有效的治療方法十分重要。溫針灸為針刺與艾灸的結合,能行氣活血、溫通經脈,可用于治療關節痹痛與肌膚不仁[3]。桂枝芍藥知母湯可治療痹病,有解毒止痛、活血通絡與利濕散寒的功效[4]。目前臨床上關于溫針灸聯合桂枝芍藥知母湯治療類風濕關節炎的報道較少,故本研究對此展開臨床觀察。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2019年3月至2020年3月廣東省第二中醫院收治的 156例類風濕關節炎患者作為研究對象,采用隨機數字表法分為對照組和研究組,每組78例。對照組中男46例,女32例;年齡43～80歲,平均(58±19)歲;病程1～13年,平均(12.62±2.64)年。研究組中男40例,女38例;年齡44～81歲,平均(59±19)歲;病程1～14年,平均(13.02±3.05)年。兩組患者一般資料比較,差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。本研究經廣東省第二中醫院倫理委員會批準[批準號(2019)倫審第(40)號]。

1.2 納入標準

①符合《類風濕關節炎中西醫結合醫療質量控制指標專家共識(2021年版)》[5]中類風濕關節炎的診斷標準;②休息時存在關節疼痛;③關節晨僵超過 1 h;④關節壓痛數超過8個;⑤患者年齡＞40歲;⑥病程不限;⑦患者家屬均同意參加并簽署知情同意書。

1.3 排除標準

①關節嚴重畸形者;②關節功能喪失者;③有關節外傷史者;④合并有心血管疾病者;⑤有精神障礙者。

2 治療方法

兩組患者均采用常規治療?？诜装钡?湖州展望藥業有限公司,國藥準字 H20003089,規格2.5 mg/片)10 mg,每周1次,共服用8周。

2.1 對照組

予口服桂枝芍藥知母湯治療。組方為甘草 10 g,白芍藥10～30 g,生姜15 g,白術15 g,知母10～15 g,當歸15 g,防風15 g,麻黃10 g,附子15～60 g。每日1劑,水煎服2次,分早、中、晚3次服用,共服用8周。

2.2 研究組

在口服桂枝芍藥知母湯基礎上聯合溫針灸治療。足三里為主穴,上肢配穴為外關、陽池、八邪、曲池和陽溪,下肢配穴為丘墟、解溪、八風、內膝眼和昆侖。穴位皮膚常規消毒,用0.30 mm×40 mm毫針刺入穴位。取10個穴位(主穴、上肢4個穴位和下肢4個穴位),將長2 cm艾段插入針柄并點燃,保持艾段與皮膚相距約3 cm,每個穴位灸2壯。每日治療1次,治療8周。

3 治療效果

3.1 觀察指標

3.1.1 關節壓痛、腫脹和僵硬以及握力

觀察并記錄兩組患者治療前后關節壓痛個數、腫脹個數和關節僵硬時間。治療前后分別采用握力器檢測患者握力水平。

3.1.2 中醫證候積分

根據《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[6]中相關標準分為主癥和次癥。主癥包括關節壓痛、關節腫脹、屈伸不利和晨僵,次癥包括陰雨天加重、皮膚發紅和畏惡風寒。按照嚴重程度,主癥依次計 0～6分,次癥依次計0～3分;分值與癥狀嚴重程度成正比。

3.1.3 免疫球蛋白 A(immunoglobulin A, IgA)、免疫球蛋白 G(immunoglobulin G, IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)水平

治療前后分別采集所有患者清晨空腹靜脈血4 mL,離心處理 10 min,分離上層血清,-80 ℃保存待檢。采用免疫散熱比濁法檢測血清IgA、IgG和IgM水平。

3.1.4 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-37(interleukin 37, IL-37)和白介素-6(interleukin 6, IL-6)水平

治療前后分別采集所有患者清晨空腹靜脈血4 mL,離心處理 10 min,分離上層血清,-80 ℃保存待檢。采用酶聯免疫吸附法檢測血清TNF-α、IL-37和IL-6水平。

3.1.5 微小 RNA-335-5p(miR-335-5p)和微小 RNA-141(miR-141)表達

治療前后分別采集所有患者清晨空腹靜脈血4 mL,離心處理 10 min,分離上層血清,-80 ℃保存待檢。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測 miR-335-5p和miR-141水平。參照Trizol試劑盒提取總RNA,使用逆轉錄獲得總cDNA,采用Primer5.0軟件設計特異引物,擴增體系為2 μL cDNA和0.4 μL正向引物以及0.4 μL反向引物,擴增條件為25 ℃ 10 min、48 ℃30 min、95 ℃ 5 min共進行 40個循環,采用 2-△△Ct方法計算出外周血表達量。miR-335-5p上游引物序列為 5’-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGC-3’,下游引物序列為5’-CUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3’;miR-141上游引物序列為 5’-GCCTGTAGCTTTTCCTACT-3’,下游引物序列為5’-CACGGCGGTTCGTCGAGT-3’;內參U6引物序列為上游 5’-TCCAAACTAACCTTGTGCCATAC-3’、下游5’-ACACCCTTGGGTACTACATCTCC-3’。

3.1.6 不良反應發生情況

治療過程中,觀察并記錄兩組不良反應發生情況。

3.2 療效標準[6]

顯效:關節疼痛和麻木消失,相關指標恢復正常。

有效:關節疼痛減輕,相關指標好轉。

無效:關節疼痛和麻木未減輕。

總有效率＝[(顯效+有效)例數/總例數]×100%。

3.3 統計學方法

采用SPSS26.0統計軟件進行分析處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,組內比較采用配對t檢驗。計數資料比較采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3.4 治療結果

3.4.1 兩組治療前后關節壓痛、腫脹和僵硬以及握力比較

由表1可見,兩組治療前關節壓痛、腫脹和僵硬以及握力比較,差異無統計學意義(P＞0.05);兩組治療后關節壓痛個數和腫脹個數均減少(P＜0.05),僵硬時間縮短(P＜0.05),握力水平提高(P＜0.05);研究組治療后上述指標均優于對照組(P＜0.05)。

表1 兩組治療前后關節壓痛、腫脹和僵硬以及握力比較 (±s)

表1 兩組治療前后關節壓痛、腫脹和僵硬以及握力比較 (±s)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05;1 mmHg≈0.133 kPa。

組別 例數 關節壓痛個數(個) 關節腫脹個數(個)治療前 治療后10.22±1.03 5.02±0.511)10.20±1.02 3.41±0.341)2)晨僵時間(min) 治療前 治療后對照組 78 4.99±0.04 3.51±0.361)研究組 78 5.00±0.05 2.12±0.211)2)組別 例數 握力(mmHg)治療前 治療后 治療前 治療后對照組 78 125.32±12.55 67.52±6.751) 11.61±1.16 15.62±1.561)研究組 78 125.01±12.50 51.18±5.221)2) 11.60±1.15 19.65±1.961)2)

3.4.2 兩組治療前后中醫證候積分比較

由表2可見,兩組治療前患者各項中醫證候積分比較,差異無統計學意義(P＞0.05);兩組治療后各項中醫證候積分均降低(P＜0.05),且研究組治療后各項中醫證候積分均低于對照組(P＜0.05)。

表2 兩組治療前后中醫證候積分比較 (±s,分)

表2 兩組治療前后中醫證候積分比較 (±s,分)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05。

組別 例數 關節壓痛 關節腫脹 屈伸不利治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后對照組 78 4.25±0.43 2.59±0.261) 4.31±0.43 2.55±0.261) 3.88±0.38 1.85±0.191)研究組 78 4.23±0.42 1.41±0.141)2) 4.30±0.43 1.62±0.161)2) 3.89±0.39 1.22±0.121)2)組別 例數 晨僵 皮膚發紅治療前 治療后 治療前 治療后對照組 78 3.62±0.37 1.91±0.201) 1.75±0.18 1.05±0.111)研究組 78 3.60±0.36 1.22±0.121)2) 1.74±0.17 0.68±0.071)2)組別 例數 陰雨天加重 畏惡風寒治療前 治療后 治療前 治療后對照組 78 1.45±0.15 0.77±0.071) 1.55±0.16 1.06±0.111)研究組 78 1.44±0.14 0.39±0.041)2) 1.54±0.15 0.58±0.051)2)

3.4.3 兩組治療前后血清免疫球蛋白水平比較

由表3可見,兩組治療前血清IgA、IgG和IgM水平比較,差異無統計學意義(P＞0.05);兩組治療后血清 IgA、IgG和 IgM水平低于同組治療前(P＜0.05),且研究組治療后血清IgA、IgG和IgM水平均低于對照組(P＜0.05)。

表3 兩組治療前后血清免疫球蛋白水平比較 (±s, g/L)

表3 兩組治療前后血清免疫球蛋白水平比較 (±s, g/L)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05。

組別 例數 IgA IgG IgM治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后對照組 78 3.21±0.33 2.46±0.311) 20.36±2.18 14.62±1.521) 1.40±0.15 1.05±0.111)研究組 78 3.20±0.32 2.15±0.261)2) 20.38±2.20 10.09±1.211)2) 1.39±0.14 0.89±0.091)2)

3.4.4 兩組治療前后血清炎癥因子水平比較

由表4可見,兩組治療前血清 TNF-α、IL-37和IL-6水平比較,差異無統計學意義(P＞0.05);兩組治療后血清TNF-α、IL-37和IL-6水平均降低(P＜0.05),且觀察組治療后TNF-α、IL-37和IL-6水平均低于對照組(P＜0.05)。

表4 兩組治療前后血清炎癥因子水平比較 (±s, ng/L)

表4 兩組治療前后血清炎癥因子水平比較 (±s, ng/L)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05。

組別 例數 TNF-α IL-37 IL-6治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后對照組 78 241.36±25.61 166.30±18.631) 220.58±24.06 150.36±17.041) 34.10±3.46 26.52±2.651)研究組 78 240.94±24.09 129.55±14.261)2) 221.01±23.95 95.85±10.361)2) 33.99±3.41 15.42±1.541)2)

3.4.5 兩組治療前后血清miR-335-5p和miR-141表達比較

由表5可見,兩組治療前血清 miR-335-5p和miR-141表達比較,差異無統計學意義(P＞0.05);兩組治療后血清 miR-335-5p表達升高(P＜0.05),miR-141表達降低(P＜0.05);觀察組治療后血清miR-335-5p表達高于對照組(P＜0.05),血清miR-141表達低于對照組(P＜0.05)。

表5 兩組治療前后血清miR-335-5p和miR-141表達比較 (±s)

表5 兩組治療前后血清miR-335-5p和miR-141表達比較 (±s)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05。

組別 例數 miR-335-5p miR-141治療前 治療后 治療前 治療后對照組 78 1.56±0.16 3.61±0.361) 2.61±0.26 1.85±0.191)研究組 78 1.55±0.15 5.24±0.521)2) 2.60±0.25 1.05±0.111)2)

3.4.6 兩組臨床療效比較

由表6可見,觀察組總有效率高于對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表6 兩組臨床療效比較 (例)

3.5 兩組不良反應發生率比較

由表7可見,兩組患者不良反應發生率比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。

表7 兩組不良反應發生率比較 (例)

4 討論

類風濕關節炎主要以小關節發病為主,臨床發病機制不明確,屬中醫學“痹證”“歷節風”范疇。該病病程較長,中醫學認為發病原因為患者正氣不足,風寒濕熱等侵襲機體,導致關節肌肉麻木、屈伸不利,出現變形,對此病進行及時的治療可有效控制其發展[7-9]。

人體重要的免疫抗體為IgA、IgG、IgM。IgA為參與黏膜局部免疫的抗體,IgG為機體免疫應答的抗體,IgM為體液免疫的最早抗體。IgA、IgG和IgM水平異常升高可導致機體體液免疫紊亂,且參與類風濕關節炎的發生[10-12]。本研究通過檢測患者血清IgA、IgG和IgM水平評估患者的免疫反應,結果表明溫針灸聯合桂枝芍藥知母湯治療類風濕關節炎可降低患者 IgA、IgG和IgM水平,使患者的免疫反應得到調節,有助于病情恢復。在關節炎癥反應中TNF-α、IL-37和IL-6發揮重要作用[13-15]。IL-37為炎癥免疫抑制劑,在炎癥反應時表達升高;TNF-α在炎癥反應中作用較為關鍵,隨著病情的發展而升高。本研究結果表明,治療后類風濕關節炎患者血清中TNF-α、IL-37和IL-6水平降低,表明溫針灸聯合桂枝芍藥知母湯治療可抑制炎癥溢出,調節患者的免疫功能,并降低骨關節損傷發生。

miRNAs長度為22個小核苷酸,來源于內源染色體的非編碼單鏈 RNA,具有高度保守性,在多個細胞的遷移、侵襲、凋亡中發揮著作用,穩定存在于多種組織與細胞,miRNAs可與靶mRNA特異性的堿基配對,使其降解,并調控基因進行轉錄表達[16-17]。研究[18]表明,miRNAs為治療自身免疫性疾病的靶點,與類風濕關節炎的發生、發展存在著密切的關系,miR-335位于7q32.2上,具有調節細胞增殖遷移與分化的作用,miR在進化上高度保守,并具有嚴格的組織及時序特異性,異常表達時可促進疾病的發生。研究[19]表明,miR-335可調節骨動態平衡,miR-335-5p與類風濕關節炎發展密切,在類風濕關節炎的發展中起抑制作用。臨床研究[20]顯示,miR-335-5p可靶向于多種mRNA的表達,可通過靶向 ICAM-1使甲狀腺癌細胞的侵襲與轉移受到抑制,還可通過靶向BCL2L2使順鉑對卵巢癌的敏感性提高,且miR-335-5p可下調LDHB使直腸癌的細胞的增殖與侵襲受到抑制。本研究結果顯示,治療后 miR-335-5p表達升高,表明溫針灸聯合桂枝芍藥知母湯可抑制關節炎的發展,其可能為類風濕關節炎的保護基因。miR-141表達與軟骨組織,可減少成骨表達與成骨作用,與骨細胞的代謝生長、腫瘤與炎癥關系密切,miR-141在非酒精脂肪肝進展中表達升高,降低其表達可減少脂肪肝變性與炎癥反應[21]。miR-141表達升高可使類風濕關節炎患者的炎性反應與成骨細胞的代謝受到影響,促進類風濕關節炎的發生與發展。本研究表明,溫針灸聯合桂枝芍藥知母湯可使 miR-141在類風濕關節炎患者中表達降低,表明聯合治療可使其炎癥的溢出受到抑制,調節患者的免疫功能,并降低骨關節損傷發生。本研究對聯合治療的具體作用機制并未深入研究,有待進一步研究。

綜上所述,在常規治療基礎上,溫針灸聯合桂枝芍藥知母湯治療類風濕關節炎可減少關節壓痛個數與關節腫脹個數,降低患者血清炎癥因子水平,提高患者握力,可能與調控miR-335-5p和miR-141表達有關。