不同鹵水添加量對豆腐凝膠特性的影響

力雯慧，張志衡，楊雅婧，李玉娥，陳振家*

山西農業大學食品科學與工程學院（晉中 030801）

大豆起源于中國，距今已有數千年的歷史，具有較高的營養價值，主要成分有蛋白質（40%）、碳水化合物（35%）和油脂（20%）。豆腐是中國傳統的豆制品，其營養豐富、熱量較低，深受大眾喜愛。豆腐主要是大豆經過浸泡、磨漿、煮漿、點漿、蹲腦和壓制成型等工藝制成的[1]，其中點漿是最關鍵的一步。凝固劑的選擇對豆腐的感官性質有著重要影響。劉寧等[2]將凝固劑分為7種，即鹽類凝固劑、酸類凝固劑、酶類凝固劑、豆清發酵液、復合凝固劑、多糖類凝固劑和生物凝固劑。試驗用到的是鹽類凝固劑，市場上常見的鹽類凝固劑主要分為鎂鹽和鈣鹽2種，常用的有鹵水（主要成分為MgCl2）和石膏（主要成分為Ca2SO4），使用鹽凝固劑做出來的豆腐風味鮮美，出品率高但存放期短。

鹵水豆腐是我國最常見的豆腐，使用的凝固劑一般稱之為鹵水，其主要成分為氯化鎂。鹵水豆腐具有較大的彈性及較強的硬度和韌性，質地不如內酯豆腐質地軟嫩，水分相對較低，在80%左右，但彈性較好，而正是由于水分少，故而鹵豆腐特有的風味更加濃，質地更硬且更適宜烹飪。但現階段對于鹵水豆腐品質特性的研究不夠深入，關于鹵水豆腐凝固機理存在很大爭議，這些問題需要進一步探究。試驗主要研究鹵水豆腐凝膠特性和凝固過程隨鹵水（MgCl2）添加量的變化規律，為鹵水豆腐的凝固機理提供數據參考。

1 材料與儀器

1.1 原料與試劑

大豆（綏化市正大米業有限公司）；考馬斯亮藍G-250、β-巰基乙醇、牛血清蛋白、SDS、溴酚藍、過硫酸銨、低分子量蛋白標樣、三羥甲基氨基甲烷、四甲基乙二胺（北京索萊寶科技有限公司，分析純）；甲叉雙丙烯酰胺、無水乙醇、甘氨酸、甘油（生工生物工程股份有限公司，分析純）；氯化鈉、尿素、羅丹明（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；氫氧化鈉（天津市凱通化學試劑有限公司，分析純）；硫酸（成都市科隆化學品有限公司，分析純）；氯化鎂（安琪酵母股份有限公司，食品級）；硫酸鉀（天津市科密歐化學試劑開發中心，分析純）；硫酸銅（天津市北辰方正試劑廠，分析純）。

1.2 主要設備與儀器

FSM-120-4P型分離式磨漿機（沈陽市食品機械制造有限公司）；XS-C型成型機（天思食品機械有限公司）；TMS-Pro質構儀（Food Technology Corporation）；DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；UV-1200型可見分光光度計（上海菁華科技有限儀器公司）；HH型數顯恒溫水浴鍋、79-1型磁力加熱攪拌器（金壇市科析儀器有限公司）；HC-2064型高速離心機、KDC-1044L型大容量低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；DY89-Ⅱ型電動玻璃均質機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Tensor 27型傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker德國布魯克）；SCIENTZ-18N型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TCS SP8型激光掃描共聚焦顯微鏡（Leia）。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆乳的制備

參考Guo等[3]的方法并做一定修改。將大豆用清水清洗3次，在室溫下浸泡12 h，待水分瀝干后，將大豆與水以1∶5（g/mL）比例混合磨漿，粗漿經0.075 mm孔徑（200目）過篩去除豆渣后，加熱煮沸5 min，保溫備用。

1.3.2 鹵水豆腐的制備

將黃豆清洗3次，去除雜質和灰塵，在室溫下浸泡約12 h。待水分瀝干后，將黃豆與水以1∶5（g/mL）比例混合，利用分離式磨漿機磨漿，加熱煮沸5 min。配制15%鹵水（MgCl2溶液）作為凝固劑，在豆漿溫度下降到85 ℃時，加入鹵水進行凝固，鹵水添加量分別為2.0%，3.5%和5.0%（V/V），85 ℃下保溫10 min，使用成型機壓制成型。

1.3.3 鹵水豆腐質構性的測定

將制備好的鹵水豆腐切成4 cm×4 cm×1 cm立方體，采用質地多面剖析法（TPA）測定豆腐質構特性[4]。測試參數：測試速度60 mm/s，測試后速度200 mm/s，探頭回升高度15 mm，擠壓距離5 mm，測試間隔3 s，起始力0.4 N；每個樣品需重復測定10次。

1.3.4 鹵水豆腐得率、含水量及保水性的測定

按照Kang等[5]的方法測定豆腐得率，將制作好的豆腐于室溫下靜置5 min后稱重，計算100 g干大豆所得豆腐的質量，即為豆腐得率，按式（1）計算。

式中：W1為豆腐質量，g；W2為干大豆質量，g。

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的直接干燥[6]測定豆腐的含水量（MC）。

根據王睿粲[7]的方法測定豆腐保水性。選用帶有內管的50 mL離心管，內管底部為網狀，放入濾紙片后，稱取濾紙片和內管的質量m1，將約1 g豆腐放在濾紙上，稱內管和豆腐的總質量m2，以4 000 r/min離心10 min后，再次稱內管和豆腐的質量m3，豆腐的保水性按照式（2）測得。

1.3.5 鹵水豆腐中蛋白質含量的測定

蛋白質含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[8]。

1.3.6 鹵水豆腐凝膠作用力的測定

參考Gómez-Guillén等[9]方法。用小刀切取3 g豆腐凝膠放入研磨器內，分別與20 mL的0.05 mol/L NaCl（SA）、0.6 mol/L NaCl（SB）、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素（SC）、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素（SD）和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.2 mol/L β-ME（SE）破碎均質，定容后以10 000×g離心10 min。利用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質含量。溶解于SB溶液與SA溶液中蛋白質含量之差表示離子鍵的貢獻，溶解于SD溶液與SC溶液中蛋白質含量之差表示疏水性相互作用的貢獻，溶解于SC溶液與SB溶液中蛋白質含量之差表示氫鍵的貢獻，溶解于SE溶液與SD溶液中蛋白質含量之差表示二硫鍵的貢獻。

1.3.7 SDS-PAGE

樣品的制備：準確稱取5 mg鹵水豆腐加入樣品處理液中，加蒸餾水使總體積為1 mL，振蕩均勻冷藏后可進行使用。若樣品為液體，則需根據蛋白濃度確定，使最終溶液中蛋白濃度為1 mg/mL。

SDS-PAGE電泳采用Lars等[10]的方法，制得的分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，上樣量6 μL，恒壓電泳，電流40 mA，濃縮膠電壓100 V，分離膠電壓150 V。電泳完畢，固定2 h，染色3 h，脫色2 h，結束后拍照成像，并分析圖譜。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜分析

參照Shin等[11]的方法。將制備好的生豆漿、熟豆漿及豆腐在真空冷凍干燥作用下凍干成粉狀。將凍干樣品和KBr以1∶100（W/W）比例在研缽內研磨均勻，使用壓片機將混合物壓成明片狀（壓力10 MPa、時間1 min），準備完成后即可進行測定。所選用的波長范圍為400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數24次。利用Peakfit軟件對測定圖譜進行基線校正、去卷積和高斯擬合處理，根據峰與二級結構的對應關系，利用各子峰面積計算二級結構的相對含量。

1.3.9 凝膠微觀結構分析

依據上述的方法制備豆乳，微觀結構的測定參考Kuipers等[12]方法并稍作改動。取100 mL豆乳加入1 mL 0.2%羅丹明溶液，攪拌均勻，分別配制鹵水添加量0，2.0%，3.5%和5.0%的混合溶液，迅速振蕩均勻取10 μL滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，周圍滴加少量指甲油防止水分蒸發，用錫紙包裹，在90 ℃保溫箱中保溫1 h，冷卻至室溫，測試前樣品置于陰暗處。使用TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡對凝膠的內部結構進行觀察，樣品的激發波長是543 nm，檢測范圍580～700 nm。

1.3.10 數據分析

利用Origin 8.0和Excel軟件統計分析數據并作圖，用SPSS軟件分析不同處理間差異性，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 鹵水添加量對豆腐質構性的影響

豆腐的質構特性是評價其品質的重要方式之一。選擇硬度、彈性、內聚性和咀嚼性4個參數進行分析。有研究指出[13]，豆腐的質構特性是蛋白質三維網絡結構特性的外在表征，三維網絡結構構建的強弱取決于參與蛋白數量和凝膠形成方式。

由表1可知，隨著鹵水添加量的增加，豆腐的硬度和咀嚼性顯著增加，內聚性先降低后升高，彈性先升高后降低，表明鹵水添加量改變了豆腐的質構特性，隨著鎂離子含量增加，蛋白質聚集程度增加，網絡結構的形成更為完善，凝膠硬度增加。這可能是導致豆腐質構特性發生變化的原因。

表1 鹵水添加量對豆腐質構性的影響

2.2 鹵水豆腐得率、含水量及保水性的測定

豆腐水分狀態一般用含水量、得率和保水性表示。豆腐含水量是指制得的鮮豆腐中的水分比例；豆腐得率是指一定質量的干大豆能夠制得的豆腐質量，它主要反映豆漿中的蛋白向豆腐凝膠轉化過程中轉化率的高低[14]；凝膠保水性是指蛋白質凝膠保留水分的能力，它不僅決定凝膠網絡結構的細膩程度，還與相關食品的品質有關[15]。

由圖1可知，2.0%鹵水添加量制備的豆腐含水量、保水性和得率均達到最高，分別為77.96%，46.85%和166.74%，并隨著鹵水添加量的增加均逐漸降低，可以看出較低的鹵水添加量有利于制備含水量高的嫩豆腐。

圖1 鹵水添加量對豆腐含水量、保水性及得率的影響

2.3 鹵水豆腐中蛋白質含量的測定

由圖2可知，在鹵水豆腐制備過程中，隨著鹵水添加量的增加，豆腐的總蛋白含量逐漸增加，豆腐中可溶性蛋白含量很少（約0.2%），且隨鹵水添加量的增加未發生明顯變化，說明鹵水豆腐中的蛋白質基本都參與豆腐凝膠結構的形成，只有極少量的可溶性蛋白包裹在凝膠結構內部。

圖2 鹵水添加量對豆腐中蛋白含量和可溶蛋白含量的影響

由圖3可知，通過對鹵水豆腐中蛋白質亞基組成的測定，結果發現隨著鹵水添加量的增加，豆腐中亞基條帶逐漸加深，可溶性蛋白中幾乎沒有出現亞基條帶，不溶性蛋白的亞基組成與豆腐中的亞基組成基本一致，進一步證明鹵水豆腐中的蛋白質主要為不可溶蛋白；加入還原劑后，一些大分子聚集體分解，亞基條帶增多，說明二硫鍵參與鹵水豆腐蛋白質凝膠的形成。

圖3 鹵水添加量對豆腐中蛋白質亞基組成的影響

2.4 鹵水豆腐凝膠作用力

豆腐在形成凝膠的過程中，通過分子間作用力的變化，其網絡結構不同。形成蛋白網絡結構主要是通過疏水作用、氫鍵、離子鍵等非共價鍵和二硫鍵等共價鍵，在這些作用力的影響下，凝膠達到平衡狀態[16]；向豆腐中加入不同含量的鹵水，豆腐凝膠中的作用力也會發生變化。

由圖4可知：鹵水豆腐中的分子間作用力包含疏水作用、二硫鍵、離子鍵和氫鍵，其中疏水作用占比最高，也最為重要，鹵水豆腐中作用力貢獻大小排序為疏水作用＞氫鍵＞二硫鍵＞離子鍵。隨著鹵水添加量的增加，疏水作用增加，二硫鍵大幅下降，氫鍵和離子鍵先增加后減少。由于作用力的結果是根據豆腐凝膠在不同溶液中的溶解度差異計算的，因此不能反映不同豆腐中作用力含量的絕對值，只能反映各作用力在豆腐中所占比例?？偟膩碚f，改變鹵水添加量后豆腐中作用力組成變化明顯，結合豆腐中蛋白含量的測定結果可知，增加鹵水添加量后，豆漿中的部分蛋白通過疏水作用結合到凝膠網絡中，從而改變了豆腐中作用力的比例。

圖4 鹵水添加量對豆腐中作用力組成的影響

2.5 SDS-PAGE電泳

由圖5（A）可知：鹵水豆腐在SA、SB、SC、SD這4種溶液中的亞基條帶逐漸增加，說明離子鍵、氫鍵和疏水作用參與鹵水豆腐的形成，在SA、SB、SC溶液中蛋白主要是以分子量較小的11S亞基形式存在；而SD溶液中亞基組成大幅增加且7S亞基占據主導地位，說明鹵水豆腐中7S亞基間的連接主要依靠的是疏水作用，離子鍵和氫鍵在豆腐形成中的貢獻較低且主要作用于11S的A、B亞基；對比圖5（A和B）可知，加入還原劑后，豆腐的蛋白亞基組成發生變化，主要表現在A3亞基的出現、B亞基顏色的加深以及大聚集體（分子量大于100 kDa）的消失，這些亞基主要是在二硫鍵的作用下參與鹵水豆腐的形成。隨著鹵水添加量的增加，亞基條帶顏色加深，表明增加鹵水添加量，分子間作用力增強，更多的蛋白亞基參與到豆腐的形成。

圖5 不同作用力下鹵水豆腐蛋白亞基組成

電泳的結果與鹵水豆腐分子間作用力的測定結果符合，疏水作用和二硫鍵是鹵水豆腐中的主要作用力，疏水作用主要參與7S蛋白的形成，11S蛋白的形成主要與離子鍵、氫鍵和二硫鍵有關。

2.6 鹵水豆腐紅外測定

豆腐在形成過程中，其二級結構發生明顯的變化，凝膠網絡結構與蛋白質二級結構具有密切的關聯性[17-18]。紅外光譜圖上不同波峰對應不同的基團，如3 250～3 400 cm-1歸屬于羥基基團，脂肪族氨基酸殘基分別在2 800～3 000 cm-1和1 440～1 465 cm-1附近歸屬于C—H拉伸和彎曲模式，酰胺Ⅰ帶是研究二級結構最有用的帶，被指定為C＝O拉伸振動，由1 600～1 700 cm-1范圍內的波段組成，1 600～1 640，1 640～1 650，1 650～1 660和1 660～1 700 cm-1分別屬于β折疊、無規則卷曲、α螺旋、β轉角結構[19]。通過對不同豆腐中蛋白質二級結構的測定，能夠反映出凝固劑添加量對豆腐中蛋白質聚集狀態的影響。

由圖6可知，隨著鹵水添加量的增加，3 250～3 400 cm-1處羥基基團吸收峰強度降低，氫鍵作用減弱。由表2可知，生豆漿中蛋白質結構主要是以β折疊（32.47%）和β轉角（34.33%）為主，α螺旋和無規則卷曲含量相近，分別為16.66%和16.54%。與生豆漿相比，熟豆漿中除β折疊含量增加外，其他3種結構都有不同程度的減少，這主要是由于加熱使得豆漿中蛋白質變性，空間結構展開，在氫鍵、疏水作用等化學鍵的作用下，蛋白質發生聚集的趨勢增大，即大豆蛋白的熱聚集行為[20]。與豆漿相比，鹵水豆腐中β折疊和β轉角含量大幅降低，α螺旋含量大幅增加，無規則卷曲含量小幅增加。鹵水添加量對豆腐中蛋白質二級結構的影響顯著，β折疊的含量隨著鹵水添加量的增加而增加，從12.27%增加到13.61%。β轉角含量先降低后升高，從14.23%下降到13.2%，后升高至13.99%。α螺旋含量顯著降低，從53.1%下降至44.82%。無規則卷曲含量顯著增加，從20.41%上升到27.59%。鹵水豆腐蛋白質二級結構的有序性整體提高，不同鹵水添加量下豆腐中二級結構的差異性是其表現出不同凝膠特性的重要原因。

圖6 不同鹵水添加量制備的豆腐中蛋白質紅外光譜分析

表2 鹵水豆腐中蛋白質二級結構百分比圖 單位：%

2.7 不同鹵水添加量下豆乳凝膠的微觀結構變化分析

利用激光共聚焦顯微鏡掃描技術可以更直觀地觀察豆乳凝膠的絮凝狀態。圖7中的簇狀堆積部分是蛋白質聚集體經過羅丹明標記后形成的區域，而圖中的空隙部分代表水分的分布區域。結果表明，不添加鹵水時，熟豆乳體系中的蛋白質粒子分布均勻、致密緊實，說明蛋白質沒有發生大量聚集，而添加2%的鹵水后，豆乳體系中的蛋白質分開始聚集，逐漸形成凝膠網絡結構，但此時的凝膠結構較為連續，凝膠鏈狀結構形成不充分，且蛋白聚集體間的空隙較小。隨著鹵水添加量的增加，豆乳體系中蛋白質的聚集程度進一步增加，聚集體間的孔隙明顯變大且分布均勻，表明鹵水添加量的增加極大地增大了蛋白質的聚集程度，凝膠結構變得更加有序，網絡結構形成更為充分。

圖7 不同鹵水添加量形成凝膠的的CLSM圖

3 結論

通過比較不同鹵水添加量制備的鹵水豆腐的凝膠特性發現，隨著鹵水添加量的增加，豆腐的硬度和咀嚼性增加，質構特性發生顯著性變化。豆腐的含水量、保水性和得率隨著鹵水添加量的增加而逐漸降低，且可溶性蛋白含量逐漸降低，疏水作用增加，二硫鍵占比明顯下降，疏水作用主要參與7S蛋白的形成，離子鍵、氫鍵和二硫鍵主要作用于11S蛋白。在加熱的作用下，豆漿中的β折疊含量增加，蛋白質發生大的聚集，而隨著鹵水添加量的增加，β折疊和無規則卷曲含量增加，β轉角含量先降低后升高，α螺旋含量明顯下降，鹵水添加量對豆腐中二級結構產生顯著影響。