UPLC-MS/MS檢測轉基因大豆及其副產物中的草甘膦及代謝物

徐君輝，沈飚，高卓瑤 *，倪魯波，呂款款，徐依婷

1.舟山海關綜合技術服務中心（舟山 316000）；2.浙江海洋大學食品與藥學學院（舟山 316000）；3.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院（舟山 316000）

大豆富含脂肪、蛋白質、磷脂等營養物質，還是重要的油料作物，其副產物豆粕還可作為動物的蛋白質飼料添加物[1]。我國是全球轉基因大豆進口量和壓榨量最大的國家[2]。草甘膦（glyphosate，GLY）是一種非選擇性有機磷除草劑，具有高效、低毒、易降解等特點，是目前世界上應用范圍最廣、生產量最大的除草劑[3]。草甘膦殘留是轉基因大豆中最主要的農藥殘留問題。2015年，草甘膦被國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IRAC）列為2A類致癌物后，各國對其用量和殘留限量進行嚴格控制。但在我國GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》，尚未對轉基因大豆中的草甘膦最大殘留限量作出規定[4-6]。

檢測草甘膦主要方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[7-8]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-11]、氣相色譜-質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）[12-14]、液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）[15-20]、離子色譜法（ion chromatography，IC）[21-22]和毛細管電泳法（capillary electrophoresis，CE）[23]。IC不適用于轉基因大豆這類高脂肪、高蛋白的復雜基質。GC和GC-MS在上機檢測前需將目標化合物轉為可氣化物質，耗費試劑較多，過程復雜，耗時過長。HPLC和LC-MS對前處理要求較高，受基質干擾影響較大，靈敏度不高。柱前衍生-液質聯用法是近幾年來檢測草甘膦和氨甲基膦酸的常用方法，但現有報道主要針對于水、土壤、茶葉等基質[24-25]。

試驗針對轉基因大豆及其副產物基質的特點，采用0.1%鹽酸溶液提取，二氯甲烷脫脂，RM固相萃取柱凈化后，與四硼酸鈉溶液和芴甲氧羰酰氯溶液衍生，通過超高效液相色譜-串聯質譜儀進行測定，同位素內標法定量。該方法前處理過程簡單、靈敏度高、穩定性好，不僅能滿足日常檢測要求，還可為相關監管部門提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉基因大豆樣品（隨機購買自浙江省各農貿市場及超市）；豆粕和大豆油（轉基因大豆壓榨而得）。

草甘膦標準品、氨甲基膦酸標準品、同位素1，2-C13N15草甘膦標準品（純度≥95%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；乙腈、二氯甲烷、鹽酸、四硼酸鈉、FMOC-Cl（色譜純，中國醫藥集團有限公司）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；草甘膦檢測基質方法包（SBEQ-CA5866，上海安譜實驗科技股份有限公司）；試驗用水（經Milli-Q凈化的超純水，美國Milli-pore公司）。

1.2 儀器與設備

Waters Xevo TQ-XS超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（美國沃特世公司）；Multi Reax多孔位旋渦混合器（德國海道爾夫公司）；AVANTIJ-E高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；KQ-600DV數控超聲波清洗器（中國江蘇昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Milli-pore公司）；BSA224S-CW電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

GLY、AMPA混合標準儲備液：準確稱取10 mg草甘膦標準品和氨甲基膦酸標準品于同一個10 mL容量瓶中，用純水溶解并定容至標準刻度線，混勻，配制成質量濃度為1 mg/mL的混合標準儲備液，于4 ℃冰箱保存。

GLY、AMPA混合標準中間液：準確吸取0.1 mL GLY、AMPA混合標準儲備液于100 mL容量瓶中，用純水定容至標準刻度線，混勻，配制成質量濃度1 μg/mL的混合標準中間液，于4 ℃冰箱保存。

GLY、AMPA混合標準工作溶液：分別吸取1 μg/mL GLY、AMPA混合標準中間液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 mL于7只100 mL容量瓶，用純水定容至標準刻度線，得1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL混合標準工作溶液。

同位素內標溶液：準確稱取0.10 mg同位素1，2-C13N15草甘膦標準品于100 mL容量瓶中，用純水定容至標準刻度線，混勻，配制成質量濃度1 μg/mL的同位素內標溶液。

1.3.2 樣品的前處理

提取：將大豆置于粉碎機粉碎，過0.250 mm孔徑（60目）篩得到質化后的轉基因大豆樣品，準確稱取2 g均質后的大豆樣品于50 mL離心管中，加入50 μL 1 μg/mL 同位素內標溶液，加入10 mL 0.1%鹽酸溶液，渦旋混合1 min（轉速2 000 r/min），加入100 mg草甘膦檢測基質方法包，渦旋混合1min（轉速2 000 r/min），加入10 mL二氯甲烷，渦旋混合1 min（轉速2 000 r/min），在40 kHz頻率下超聲提取15 min，在10 000 r/min下離心5 min，取上清液，待凈化。

移動評價對于鄰域結構的搜索耗時問題具有重要影響，精確方法存在計算耗時的問題，近似方法能夠快速對新解進行評價，過濾出最有可能引導算法搜索到改進解的移動，甚至有時可能比精確方法更準確。FJSP跨機器移動工序和同機器移動工序時，近似評價方法分別具體如下：

凈化：取5 mL上清液過RM固相萃取柱（使用前先用6 mL甲醇活化，用6 mL去離子平衡），收集后2.5 mL凈化液，待衍生。

衍生：取1 mL凈化液于5 mL離心管中，加入0.2 mL 5%四硼酸鈉緩沖溶液和0.2 mL 1 mg/mL FMOC-Cl乙腈溶液，渦旋混合30 s（轉速2 000 r/min），密封，置于40 ℃烘箱內下衍生2 h，冷卻至室溫，過0.22 μm有機微孔濾膜得待測液，上機檢測。

1.3.3 儀器分析參數

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫45 ℃；進樣量10 μL；流速0.30 mL/min；流動相A為0.1%甲酸乙腈；流動相B為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液；洗脫方式采用梯度洗脫；洗脫程序：0～3.5 min時，A相體積分數由10%逐漸增加至30%，3.5～3.7 min時，A相體積分數由30% 逐漸增加至95%，3.7～10 min時，A相體積分數保持在95%，10～10.2 min 時，A相體積分數由95%逐漸減少至10%，10.2～12.0 min，A相體積分數保持在10%，平衡5 min。

1.3.3.2 質譜條件

質譜條件為：離子源采用電噴霧電離（ESI）；掃描方式采用正離子掃描方式；采集模式采用多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓1.0 kV；霧化器溫度500 ℃；錐孔氣流速50 L/h；霧化氣流速1 000 L/h；離子源溫度150 ℃。目標化合物的質譜參數見表1。

表1 草甘膦和氨甲基膦酸的質譜參數

1.4 數據處理

所有試驗數據均采用Qrigin 8.0進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸都屬于強極性物質，易溶于水，難溶于丙酮、乙醇等有機溶劑，因此，試驗選用水作為主要提取溶劑。此外，轉基因大豆含有豐富的脂肪和蛋白質，且大部分呈水溶性，能溶解在水中。在提取溶劑中加入適量的鹽酸可起到沉淀提取液中蛋白質的作用。對比水、0.1%鹽酸溶液、0.5%鹽酸溶液、1.0%鹽酸溶液4種不同溶劑的提取效果。以轉基因大豆加標樣品為例，分別采用4種溶劑進行提取，保持其他條件一致。由圖1可知，0.1%，0.5%和1.0%鹽酸溶液提取后回收率均高于純水提取，且使用0.1%鹽酸溶液時，提取效果最好，因此選擇0.1%鹽酸溶液作為提取試劑。

圖1 不同溶劑對草甘膦和氨甲基膦酸回收率的影響（n=3）

2.2 衍生條件優化

柱前衍生指待測液在進行色譜柱分離前，通過與化學試劑反應，將難于分析檢測的目標化合物定量轉化成另一種易于分析檢測的化合物。衍生溫度高低和衍生時間長短都是影響衍生反應的重要因素。在1.0 mL質量濃度100 ng/mL的GLY、AMPA混合標準工作溶液中加入0.2 mL 5%四硼酸鈉緩沖溶液和0.2 mL 1 mg/mL FMOC-Cl乙腈溶液，并分別置于20，30，40和50℃烘箱內進行衍生，其他條件保持一致，結果如圖2所示。衍生溫度40 ℃時，草甘膦和氨甲基膦酸的回收率最佳。在1.0 mL質量濃度100 ng/mL的GLY、AMPA混合標準工作溶液中加入0.2 mL 5%四硼酸鈉緩沖溶液和0.2 mL 1 mg/mL FMOC-Cl乙腈溶液，分別衍生1，2，4，6和12 h，其他條件保持一致，結果如圖3所示。在衍生時間2～6 h范圍內，草甘膦和氨甲基膦酸的回收率均能達到要求，綜合考慮，衍生時間為2 h。

圖2 衍生溫度對草甘膦和氨甲基膦酸回收率的影響（n=3）

圖3 衍生溫度對草甘膦和氨甲基膦酸回收率的影響（n=3）

2.3 UPLC-MS/MS條件優化

分別對比HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）4種ACQUITY UPLC色譜柱對草甘膦和氨甲基膦酸的分離效果。結果表明，采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱時，目標化合物的分離效果相對較好，不受雜峰干擾，響應值高。因此，選擇ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱為分離柱。

按1.3.3選定的色譜條件，根據草甘膦和氨甲基膦酸的電離性質，采用ESI正離子模式對衍生后的混合標準工作液進行全掃描分析，對碰撞電壓、去簇電壓等關鍵質譜參數進行優化，通過對比響應值高低來確定目標化合物的最佳質譜條件，具體質譜參數見表1，色譜峰結果見圖4。

圖4 目標化合物的MRM色譜圖

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

準確吸取適量GLY、AMPA混合標準中間液和同位素內標溶液，用純水分別定容至質量濃度1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 ng/mL的系列混合標準工作溶液（同位素內標質量濃度均為5 ng/mL）。按1.3.2所述方法衍生后，用UPLC-MS/MS進行分析檢測。將定量離子與同位素內標峰面積比值作為縱坐標（Y），質量濃度與內標濃度比值為橫坐標（X），繪制標準工作曲線，計算線性回歸方程和相關系數，結果見表2。

選用陰性轉基因大豆樣品，加入適量GLY、AMPA混合標準工作溶液，按1.3.2所述方法對樣品進行前處理，在1.3.3的儀器工作條件下進行分析測定，分別以3倍信噪比（rSN）和10倍信噪比（rSN）計算目標化合物的檢出限和定量限，結果見表2。結果表明，草甘膦和氨甲基膦酸在1.0～100.0 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.996，檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.10～0.15 mg/kg，能滿足定量分析的需求。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.5 準確度與精密度

選用陰性樣品，分別添加0.05，0.20和0.50 mg/kg 3個水平的GLY、AMPA混合標準工作溶液，按1.3.2所述方法對樣品進行前處理，在1.3.3的儀器工作條件下進行分析測定，每個水平重復測定6次，并計算回收率和相對標準偏差，結果見表3。目標化合物的加標回收率為90.7%～109.3%，測定結果的相對標準偏差為2.44%～7.56%。因此，該方法具有良好的準確度與精密度，能滿足轉基因大豆中草甘膦和氨甲基膦酸的日常檢測需求。

表3 樣品中草甘膦和氨甲基膦酸的回收率及相對標準偏差（n=6）

2.6 實際樣品檢測

采用建立的柱前衍生-UPLC-MS/MS-內標法對來自浙江農貿市場、超市等場所的轉基因大豆及其副產物中的草甘膦和氨甲基膦酸進行分析檢測。結果見表4，草甘膦在大豆和豆粕中的檢出率較高，實測最高值分別為0.253和0.114 mg/kg，而大豆油中則未檢出；氨甲基膦酸在大豆、豆粕和大豆油中均未檢出。通過對實際樣品的檢測應用，說明該方法可用于轉基因大豆及其副產物中草甘膦和氨甲基膦酸的日常分析檢測。

表4 實際樣品中草甘膦和氨甲基膦酸的檢測結果

3 結論

針對轉基因大豆及其副產物高脂肪、高蛋白的特點，采用二氯甲烷和RM固相萃取柱凈化有效去除基質中的雜質干擾，建立柱前衍生-UPLC-MS/MS-內標法測定轉基因大豆及其副產物中草甘膦和氨甲基膦酸殘留的分析方法。該方法前處理過程操作簡單、提取率高、凈化效果好，回收率與精密度均能達到檢測要求，可為相關部門監管轉基因產品提供有力技術支持，也能為完善我國轉基因產品檢測體系提供參考。