蘋果樹腐爛病菌絲氨酸蛋白酶基因VM1G_08720的功能分析

刁雨菲,熊雄,鄭金柱,靳紀洋,于成明*,劉會香*

蘋果樹腐爛病菌絲氨酸蛋白酶基因的功能分析

刁雨菲1,熊雄2,鄭金柱3,靳紀洋2,于成明1*,劉會香1*

1. 山東農業大學植物保護學院/山東省林業有害生物防控工程技術研究中心, 山東 泰安 271018 山東農業大學林學院, 山東 泰安 271018 徂徠山林場, 山東 泰安 271027

蘋果是我國種植面積最廣的溫帶水果之一，由蘋果黑腐皮殼菌（）引起的蘋果樹腐爛病（canker of apple）是危害我國蘋果樹最為嚴重的病害之一。明確病原菌生長發育、響應環境脅迫及致病作用，解析病原菌的適應性及致病分子機制，有利于提出病害新的防控措施。本研究應用Double-joint PCR以及gap-repair方法獲得基因的缺失突變體和回補菌株。利用十字交叉法和傷口接種等方法，研究了基因對病菌生長發育和致病性的影響。通過在PDA培養基中分別添加400 μg/mL的熒光增白劑、200 μg/mL的剛果紅、0.01%的SDS三種細胞壁干擾劑和0.5 M的NaCl、0.5 M山梨醇兩種滲透脅迫因子，研究了該基因對病菌細胞壁完整性的維持及滲透脅迫的影響。通過設置不同pH的培養基，研究了基因在不同pH下對病菌生長發育的影響。研究結果顯示，與野生型sdau11-175相比，基因缺失突變體在菌落顏色、菌絲致密度、生長速率無顯著差異，分生孢子器產生數量減少；在含有200 μg/mL剛果紅、0.01%SDS的培養基上，抑制率顯著降低，在含有0.5 M NaCl的培養基上的抑制率顯著增加，而在含有400 μg/mL熒光增白劑和0.5 M山梨醇的培養基上，無顯著差異；在pH為4-10時，生長速率顯著降低，而在pH為11-12時，無顯著性差異；在蘋果果實和蘋果枝條上的病斑大小無顯著性差異，回補菌株均恢復到野生型水平。表明基因在病菌分生孢子器的產生、酸堿度的響應、維持細胞壁完整性以及滲透脅迫方面發揮重要作用。

蘋果樹腐爛病菌;基因; 絲氨酸蛋白酶; 表型分析

蘋果是我國種植面積最廣的溫帶水果之一，由蘋果黑腐皮殼菌（Miyabe et Yamada）引起的蘋果樹腐爛病（canker of apple）是分布廣泛、危害嚴重、防治困難的一種枝干性病害，該病害主要危害主干和大枝，造成蘋果樹皮腐爛，樹勢衰弱，嚴重時可造成整株死亡[1, 2]。對蘋果腐爛病菌適應性及致病分子機制進行研究有利于提出病害新的防控措施。

絲氨酸蛋白酶（S）是蛋白酶中最龐大的家族，以絲氨酸為活性中心蛋白水解酶，絲氨酸蛋白酶在治療心血管疾病、胚胎發育、組織重建、細胞分化、血管形成和病原侵入等過程中都發揮著重要的作用[3,4]。在植物病原真菌中，研究發現，煙曲霉（）中的絲氨酸蛋白酶基因ALP2缺失后，菌絲生長速度減慢，分生孢子產生數量減少，分生孢子囊直徑減少[5]。在稻瘟病菌（）中，絲氨酸蛋白酶基因和在cAMP誘導的孢子萌發和附著胞形成階段均上調表達[6]，基因的缺失突變體表現為氣生菌絲減少，分生孢子產生數量減少，致病性下降，而基因的缺失在生長發育和致病性上與野生型相比無顯著差異[7]。蘋果腐爛病菌中絲氨酸蛋白酶基因位于10號染色體上，全長1888bp，編碼606個氨基酸，登錄號為KUI73074.1，具有Peptidases_S8_S53超家族結構域，該基因對病菌生長發育及致病作用調控功能尚未研究報道。

本研究以基因為目的基因，利用Double-joint PCR技術構建敲除載體，通過PEG介導原生質體轉化法獲得敲除突變體，利用gap-repair技術獲得回補菌株；通過對野生型菌株、基因缺失突變體、回補菌株的生長發育、對脅迫因子響應、致病性等方面的比較分析，研究結果為明確基因在病菌生長發育、響應環境脅迫及致病等方面功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蘋果樹腐爛病菌野生型菌株sdau11-175由山東農業大學植物保護學院林木病原與寄主分子互作研究室提供。菌株保存在20%的甘油中，蘋果樹2年生枝條采自山東農業大學植保實驗站，蘋果果實購于市場上生長一致的富士蘋果

1.2 基因VM1G_08720 缺失突變體及回補菌株的獲得

從蘋果腐爛病菌基因組數據庫[8]NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中獲得基因序列，通過替換基因開放閱讀框（ORF），構建基因敲除突變體，以野生型菌株sdau11-175 DNA為模板，分別擴增基因的上游片段、HPH片段以及下游片段，所用引物見表1（其中08720-SY-R和08720-XY-F小寫部分，分別與HPH-F、HPH-R兩端序列反向互補）。應用Double-joint PCR方法構建敲除載體[9]，利用PEG介導法將得到的敲除載體轉化到sdau11-175的原生質體中[10]。用3對引物（表1）驗證是否敲除成功[11]。用gap repair的方法構建回補載體，以sdau11-175為模板，用表1的回補引物擴增基因片段，后與pFL2質粒相連，將得到的回補載體轉到敲除突變體的原生質體中，篩選得到回補菌株[12]。

表1 本研究所使用的引物

1.3 基因VM1G_08720 對病菌生長發育的影響

將野生型菌株sdau11-175、基因缺失突變體和回補菌株接種到PDA培養基上，25℃黑暗培養3d后測定菌落直徑大小，觀察菌落形狀、顏色、菌絲生長狀況。每個處理重復3次，試驗共重復3次，數據處理采用SPSS方法（<0.05）[13]。繼續將野生型菌株sdau11-175、基因缺失突變體和回補菌株置于光暗交替的培養基中培養25 d后，觀察分生孢子器的產生情況，實驗方法同上。

1.4 基因VM1G_08720對病菌細胞壁完整性的影響

在PDA培養基中添加了400 μg/mL的熒光增白劑、200 μg/mL的剛果紅、0.01%的SDS三種細胞壁干擾劑，觀察突變體對細胞壁干擾劑的敏感性，評價基因對病菌細胞壁完整性的調控作用，上述均在3 d后測定菌落直徑大小，每個處理重復3次，試驗共重復3次。

1.5 基因VM1G_08720對病菌滲透脅迫的影響

在PDA培養基中添加了0.5 M的NaCl、0.5 M的山梨醇兩種滲透脅迫因子，測定基因對滲透脅迫的響應，上述均在3 d后測定菌落直徑大小，每個處理重復3次，試驗共重復3次。

1.6 基因VM1G_08720對病菌酸堿性適應的影響

將培養3 d的野生型菌株sdau11-175、基因缺失突變體、回補菌株接種到不同pH值（pH為4-12）的PDA平板上，25 ℃培養3 d，測量菌落直徑。每個處理重復3次，試驗重復3次。

1.7 基因VM1G_08720 對病菌致病力的影響

選取PDA培養基上培養3 d的野生型菌株sdau11-175、基因缺失突變體和回補菌株及生長一致的成熟蘋果果實和2年生蘋果枝條，采用傷口接種法，接種后的蘋果果實和枝條置于25℃下保濕培養7 d，每個處理重復10次，試驗共重復3次。

2 結果與分析

2.1 基因VM1G_08720 缺失突變體及回補菌株獲得

以sdau11-175基因組DNA為模板，用引物08720-SY-F/R、08720-XY-F/R擴增得到了上游片段、下游片段；以PCB1003為模板，用引物HPH-F/R擴增得到了HPH片段，三片段融合后得到敲除載體，轉入原生質體后，用3對引物進行驗證，證明敲除成功（圖1A）。

以sdau11-175為模板，用引物08720HB-F/R擴增得到了回補片段，轉入原生質體后，用引物08720HB-F/R進行PCR驗證，證明回補成功，成功獲得回補菌株（圖1B）。

圖1 蘋果腐爛病菌基因VM1G_08720缺失突變體及回補菌株PCR鑒定

備注：A：3對引物對缺失突變體進行PCR驗證；B：回補菌株的PCR鑒定。

Note：A：PCR identification for deletion mutants with three pairs of primers；B：PCR identification for complementation strains.

2.2 基因VM1G_08720對病菌生長發育的影響

在25 ℃生長3 d后，與野生型菌株sdau11-175相比，基因缺失突變體在菌落顏色、菌絲致密度、生長速率無顯著差異（圖2A、2B）。繼續將菌株光暗交替培養25 d后，觀察分生孢子器產生情況，與野生型菌株sdau11-175相比，基因缺失突變體分生孢子器產生數量減少（圖2C），野生型菌株分生孢子器平均產生數量為120個，而基因缺失突變體分生孢子器平均產生數量為83個，回補菌株分生孢子器產生數量恢復到野生型水平（圖2D）。

圖2 野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株對病菌生長發育的影響

備注：A：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株的菌落形態；B：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株的菌落直徑大小；C：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株分生孢子器產生情況；D：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株分生孢子器產生數量統計。

Note: A: Colony morphology of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains; B: Colony diameters of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains; C: Pycnidia formation of the wild-type sdau11-175, deletion mutants and complementary strains; D: Analysis pycnidial numbers on wild-type sdau11-175, deletion mutants and complementary strains.

2.3 基因VM1G_08720對病菌細胞壁完整性的影響

相對于野生型菌株sdau11-175，在含有200 μg/mL剛果紅、0.01%SDS的培養基上，菌絲生長抑制率顯著降低，分別降低了50%和18%；而在含有400 μg/mL熒光增白劑的培養基上，無顯著差異，回補菌株恢復到野生型水平（圖3）。這些結果表明基因對維持細胞壁的完整性有重要作用。

備注：A：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株在不同脅迫因子下的菌落生長情況；B：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株在不同脅迫因子時的菌落直徑大小。

Note: A: Colony growth of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains under different stress factors; B: Colony diameter of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains under different stress factors.

2.4 基因VM1G_08720對病菌滲透脅迫的影響

相對于野生型菌株sdau11-175、基因缺失突變體在含有0.5 M NaCl的培養基上的菌絲生長抑制率顯著增加，增加了15%，而在含有0.5 M山梨醇的培養基上無顯著差異，回補菌株恢復到野生型水平（圖4）。這些結果表明基因對病菌滲透脅迫有重要作用。

圖4 基因VM1G_08720對病菌滲透脅迫的影響

備注：A：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株在不同脅迫因子下的菌落生長情況；B：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株在不同脅迫因子下的菌落直徑大小。

Note: A: Colony growth characters of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains under different stress factors; B: Colony diameters of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains under different stress factors.

2.5 基因VM1G_08720對病菌酸堿適應性的影響

相野生型菌株sdau11-175、基因缺失突變體及回補菌株在pH值為4-12時均能生長。與野生型菌株sdau11-175相比，在pH為4-10時，基因缺失突變體的生長速率顯著降低；而在pH為11-12時，無顯著性差異，回補菌株恢復到野生型水平（圖5）。

圖5 基因VM1G_08720對病菌酸堿適應性的影響

備注：A：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株在不同pH條件下的生長特征；B：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株在不同pH條件下的菌落直徑大小。

Note：A: Growth characters of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains under different pH; B: Colony diameter status of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains under different pH.

2.6 基因VM1G_08720對病菌致病力的影響

基因缺失突變體及回補菌株在蘋果果實和蘋果枝條上的病斑大小與野生型菌株sdau11-175無顯著性差異（圖6）。說明基因對蘋果腐爛病菌致病性影響不大，調控作用不明顯。

圖6 基因VM1G_08720對病菌致病力的影響

備注：A：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株接種蘋果果實后的癥狀；B：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株接種蘋果果實后的病斑大小；C：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株接種枝條后的癥狀；D：野生型菌株sdau11-175、缺失突變體、回補菌株接種枝條后的病斑大小。

Note: A: Symptom of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains on apple fruit after inoculation; B: Lesion sizes of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains on apple fruit; C: Symptom of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains on twigs after inoculation; D: Lesion sizes of wild-type strains sdau11-175, deletion mutants and complementary strains on apple twigs.

3 結論與討論

3.1 結論

本研究以基因為研究對象，通過Double-joint PCR的方法獲得了缺失突變體，利用gap-repair方法獲得回補菌株。通過對病菌生長發育、細胞壁完整性、滲透脅迫、酸堿度以及致病性測定，基因缺失突變體對病菌生長無影響，正調控分生孢子器的產生，在受到200 μg/ml剛果紅、0.01%SDS、0.5M NaCl脅迫時，生長受到抑制；在受到400 μg/ml CFW、0.5 M山梨醇脅迫時，與野生型菌株相比無顯著差異，在pH為4-10時，與野生型菌株相比生長速率顯著降低；在pH為11-12時，與野生型菌株相比無顯著性差異，在蘋果果實和蘋果枝條上的病斑大小與野生型菌株無顯著性差異，其回補菌株均恢復原有功能。結果表明基因在病菌發育、維持細胞壁完整性、滲透脅迫以及酸堿適應響應方面發揮重要作用；對病菌生長、致病性調控作用不顯著。

3.2 討論

絲氨酸蛋白酶在病菌生長發育方面有著重要的作用，在煙曲霉（）中，絲氨酸蛋白酶基因缺失后導致無性生長速度輕微減緩，分生孢子的產生減少，這表明絲氨酸蛋白酶在煙曲霉生長發育中發揮重要作用[5]，水稻稻瘟病菌（）中的絲氨酸蛋白酶基因可能存在冗余現象，絲氨酸蛋白酶基因缺失后能夠產生附著胞，但分生孢子產生數量減少，而另一個絲氨酸蛋白酶基因缺失后對菌絲生長及分生孢子的產生均無影響[7]。本研究中發現，當蘋果腐爛病菌絲氨酸蛋白酶基因缺失后，突變體菌絲生長無影響，但分生孢子器產生數量減少。在稻瘟病菌中，絲氨酸蛋白酶基因的缺失能夠正調控細胞壁的完整性，但不參與滲透脅迫調節，本研究中基因的缺失正調控細胞壁完整性，這與稻瘟病菌研究結果相同，基因的缺失負調控滲透脅迫，這與稻瘟病菌中的研究結果不相同。煙曲霉的絲氨酸蛋白酶基因2在pH為4.5-11之間有著廣泛的活性，這與本試驗結果一致。本研究基因缺失突變體與野生型菌株相比，致病性無顯著性差異，表明基因在致病性方面調控作用不明顯，上述結果表明基因可能與其它絲氨酸蛋白酶基因互作共同調控病菌生長發育、致病性等，今后尚需對該基因參與的調控網絡繼續深入研究，以解析其在病菌生長發育、環境脅迫及致病性調控中的分子作用機制。

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Functional Analysis of Serine Protease Genein

DIAO Yu-fei1, XIONG Xiong2, ZHENG Jin-zhu3, JIN Ji-yang2, YU Cheng-ming1*, LIU Hui-xiang1*

1.,/,271018,2./,271018,3.271027,

Apple is one of the most widely planted temperate fruits in China.canker of apple caused byis one of the most serious diseases of apple tree in China. Therefore, strengthen the scientific prevention and control of, and clarify the adaptability and pathogenic effect of pathogens to the environment is the key problem for diease. In this paper, Double-joint PCR and gap-repair methods were used to obtain deletion mutants and complement strains of the gene. The effect of the geneon nutritional growth and pathogenicity was investigated used the cross-over method and the wound inoculation. The role on the maintenance of cell wall integrity and the regulation of osmotic stress of the genewere investigated by adding 400 μg/mL calcofluor white, 200 μg/mL Congo red, 0.01% SDS, and 0.5 M NaCl, 0.5 M sorbitol. The effect of the geneon the hyphal growth of the pathogen under different pH was investigated by setting the medium for different gradient. The results showed that the genedeletion mutant was no significant differences in colony color, mycelium density, growth rate compared with wild-type sdau11-175. The numbers of pycnidial production were reduced. The inhibition rate was significantly reduced on medium containing 200 μg/mL of congo red and 0.01% SDS, and the inhibition increased significantly on medium containing 0.5 M NaCl, and there was no significant difference in the culture medium containing 400 μg/mL calcofluor white and 0.5 M sorbitol. Growth rate was significantly reduced at pH 4-10, with no significant difference at pH 11-12. There was no significant difference in diseased spot sizes between mutant and wild strain on apple fruit and apple branches. All the complement strains were recovered to wild-type levels. It indicates that the geneplays an important role in pycnidial production, pH response, maintenance of cell wall integrity, and osmotic stress.

;gene; serine proteinase; phenotype analysis

S436.611.1+1

A

1000-2324(2022)05-0735-07

2022-06-25

2022-06-05

國家自然基金項目(31770684);山東省自然科學基金項目(ZR2017MC042)

刁雨菲(1996-),女,博士研究生,專業方向林果病原與寄主分子互作機制研究. E-mail:1031151284@qq.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:ycm2006.apple@163.com; hxliu@sdau.edu.cn