黃芪多糖對過敏性鼻炎大鼠Treg/Th17細胞免疫平衡和炎癥因子的影響

劉順利,梁萌萌,劉大英,何 偉,王慶金

(1.河北省滄州中西醫結合醫院,河北 滄州 061001;2.滄州師范學院,河北 滄州 061001)

過敏性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)又稱變應性鼻炎，是主要由IgE介導的介質釋放、并有多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜變應性疾病，其因過敏源不同分為季節性AR(多為塵螨、脫屑)和常年性AR(多為花粉)，以陣發性噴嚏、清涕、鼻塞、鼻癢為主要臨床表現，其病程長、易反復，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。目前，AR的具體發病機制尚不清楚，但一般認為與調節性T細胞/T輔助細胞17(Treg/Th17)免疫失衡、炎癥反應密切相關[3]。Treg、Th17均由 CD4 T細胞分化形成，Treg具有免疫抑制作用，可維持機體免疫穩態，可分泌轉化生長因子-β1(TGF-β1)和白介素-10(IL-10)；Th17可招募局部炎癥細胞和細胞因子(如IL-17)，誘導鼻部炎性細胞浸潤和組織炎性損傷[4-5]。因此，本病治療過程中如何調節免疫細胞、降低細胞因子水平以及緩解癥狀至關重要。目前西醫治療AR以藥物(糖皮質激素、抗組胺藥、白三烯受體拮抗劑)、免疫、手術治療，上述療法可緩解患者癥狀，但是遠期療效不理想，且復發率高[6]。中醫認為AR主要為肺氣虛弱、衛表不固所致，風寒犯肺、上通鼻竅、邪正相搏、肺氣不通、津液停聚、鼻竅壅塞而發為噴嚏、流涕等癥，治療當以補肺固表、宣肺通竅為基本原則。黃芪具有益氣固表的作用，黃芪多糖為其有效成分，可顯著增強非特異性免疫功能和體液免疫功能。本研究通過建立AR大鼠模型，觀察大鼠行為學改變，ELISA法檢測血清免疫指標的改變，流式細胞技術檢測免疫細胞的分布，探討其內在的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：5～6周齡SPF級雄性SD大鼠，體重(200±20)g，動物許可證號SCXK(京)2021-0011，購自北京維通利華實驗動物有限公司。飼養環境溫度為(25±1)℃，光照12 h，避光12 h，大鼠自由進食、水，定期更換墊料。

1.1.2 實驗藥物與試劑：黃芪購自河北康博藥業有限公司；氯雷他定購自上海麥克林生化科技有限公司；卵白蛋白購自美國Sigma公司；大鼠IgE、IL-10、IL-17 ELISA試劑盒購自聯科生物；水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鋁購自美國International Laboratory公司。

1.1.3 實驗儀器：HT-300型電子天平(成都倍賽克儀表研究所);BS224S電子分析天平 (德國Sartorius公司);離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司);HH-S2S型數顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠)；多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；NovoCyte流式細胞儀 (美國艾森生物)；正置白光拍照顯微鏡Nikon(Japan)；掃描瀏覽軟件3DHISTECH(Hungary)；全景切片掃描儀3DHISTECH(Hungary)。

1.2 實驗方法

1.2.1 AR大鼠模型的建立：以卵白蛋白10 mg、氫氧化鋁粉10 mg及0.9%氯化鈉溶液1 ml混合后腹腔注射，隔日1次，連續7次，作為基礎致敏。第15天起進行加強免疫，給予5%卵白蛋白50 μl滴鼻和1%卵蛋白噴霧吸入10 min(3 ml/min)，每日1次，連續9 d。

1.2.2 黃芪多糖的提取方法：取適量黃芪粉碎，過篩后取100 g粗粉+800 ml水煎煮3次，將水煎液合并，濃縮為200 ml后，加入95%乙醇800 ml，4 ℃過夜，3000 r/min離心5 min，用水溶解沉淀，定容為200 ml，得黃芪多糖。

1.2.3 分組和給藥：將50只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、氯雷他定組(0.90 mg/kg)、黃芪多糖低劑量組(800 mg/kg)、黃芪多糖高劑量組(1600 mg/kg)，每組10只。各藥物組每天灌胃給藥1次，連續7 d，同期空白組和模型組予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃對照。造模結束股動脈抽取血液進行檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 行為學癥狀積分：激發后60 min評估大鼠癥狀積分(總分0～9分)。鼻癢：輕擦幾次鼻子1分，一直撓鼻面3分，兩者之間2分；噴嚏：1～3個1分，4～10個2分，11個及以上3分；流涕：流涕至鼻前孔1分，超出鼻前孔2分，流涕滿面3分。癥狀積分≥5分為造模成功[7]。

1.3.2 HE染色：將麻醉的大鼠固定在手術臺上，取出新鮮鼻黏膜組織，樣本經4%多聚甲醛固定，固定狀態良好后，修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，最后鏡檢。

1.3.3 流式細胞儀測定Treg、Th17占CD4+T細胞百分比：自股動脈取全血2 ml，2 h內進行流式細胞檢測。在每個流式上樣管中加入100 μl細胞懸液，細胞數約為1×106個，按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原(0.25 μl CD4抗體、1 μl CD25抗體)，用于冷的Buffer或預冷的PBS洗滌細胞，漩渦震蕩重懸細胞后加入1 ml的固定液，并在此漩渦混勻，避光4 ℃孵育30～60 min，加入2 ml Buffer工作液離心洗滌細胞并棄去上清液，避光4 ℃孵育30～60 min，加入稀釋好的2%的正常大鼠血清100 μl，避光4 ℃孵育15 min，加入稀釋好的熒光標記抗體，避光4℃孵育至少30 min，加入2 ml Buffer工作液離心洗滌細胞并棄去上清液，重復洗滌，上機檢測，并計算Treg、Th17細胞占CD4+T細胞的比例。

1.3.4 血清IgE、IL-10、IL-17含量：采集大鼠血液并離心3000 r/min離心15 min，每孔加入200 μl封閉液，37 ℃孵育1～2 h，小心揭掉封板膜，放入洗板機，洗滌3～5遍。加適當稀釋的待檢樣品100 μl于上述已包被的反應孔中。用封板膜封板后置37 ℃孵育1～2 h，小心揭掉封板膜，放入洗板機，洗滌3～5遍。于各孔中加稀釋好的生物素化抗體工作液100 μl，用封板膜封板后置37 ℃孵育1 h，小心揭掉封板膜，放入洗板機，洗滌3～5遍。也可以手動洗板：棄去液體，每孔加入300 μl洗液，浸泡1～2 min，在吸水紙上拍干，重復3～5遍。于各孔中加稀釋好的酶結合物工作液100 μl，用封板膜封板后置37 ℃避光孵育30 min，小心揭掉封板膜，放入洗板機，洗滌3～5遍。于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37 ℃避光反應10～30 min，直到倍比稀釋的標準品孔出現明顯的顏色梯度為止，于各反應孔中加入2 mmol/L硫酸100 μl，顏色由藍色變為黃色，10 min內，在酶標儀上，于450 nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學積分評定 見表1。造模前各組大鼠行為學積分比較差異無統計學意義(P>0.05)；造模后，與空白組比較，其余四組在造模后行為學積分均明顯升高(P<0.05)，說明AR模型造模成功。治療后，各給藥組與同期模型組比較，行為學積分均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；黃芪多糖低、高劑量組治療效果優于氯雷他定組(P<0.05)，黃芪多糖高劑量組優于低劑量組(P<0.05)。

表1 各組大鼠治療前后行為學積分比較(分)

2.2 各組大鼠鼻黏膜組織病理學觀察 HE染色結果(圖1)顯示：空白組大鼠鼻黏膜組織無明顯變化,上皮細胞完整無破壞。模型大鼠鼻黏膜上皮細胞部分脫落，細胞核被淺染，固有層增厚，細胞間質表現為充血和水腫，炎性細胞浸潤。氯雷他定組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖高劑量組鼻黏膜組織上皮組織較為完整,有少量的炎性浸潤。

圖1 各組大鼠鼻黏膜病理表理(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠血清IgE、IL-10、IL-17含量比較 見表2。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的IgE、IL-17水平升高，IL-10含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后，與模型組比較，各給藥組IgE、IL-17含量降低，IL-10含量升高(P<0.05)，黃芪多糖高劑量組治療效果優于其他兩組 (P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IgE、IL-10、IL-17含量比較

2.4 各組大鼠全血Treg、Th17細胞比例比較 見表3。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的Treg降低、Th17升高，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后，與模型組比較，各給藥組Treg升高、Th17降低(P<0.05)，黃芪多糖高劑量組治療效果均優于其他兩組 (P<0.05)。

表3 各組大鼠全血Treg、Th17細胞比例比較(%)

3 討 論

目前，臨床上治療AR多為西常規治療基礎上加用中藥治療，中藥復方、單味中藥、中藥內服或外用提取物均取得了不俗的療效，例如玉屏風散、桑菊飲、黃芪、蒼耳子等，上述藥物和療法均可有效緩解患者鼻塞、噴嚏、流涕等癥狀[8]。AR的發病與多重因素相關，機體免疫失衡與其密切相關，其中Th17/Treg失衡在其發病發揮重要作用[9]。Th17細胞、Treg細胞均為人體免疫的重要組成部分，Th17細胞是可分泌IL-17、IL-22的T細胞亞群，并可招募炎性細胞(尤其中性粒細胞)；Treg細胞是抑制T細胞的亞群，起負向調節作用，可分泌IL-10和TGF-β等，下調效應T細胞等多種細胞功能，二者功能大致相反[10]。正常情況下，兩種細胞維持一定動態平衡從而穩固機體免疫，病理狀態下，其可促進組織損傷、自身免疫病理損傷或自身免疫性疾病[11]。IL-17是一種具有強大的招募中性粒細胞功能的前炎性細胞因子，能夠促進多種細胞釋放炎癥因子，Th17 細胞通過產生大量的IL-17，招募中性粒細胞和誘導趨化因子CXCL8(IL-8)的產生，促使氣道黏液腺分泌大量黏液，增加氣道的高反應性，從而在多種氣道變態反應疾病中氣道重塑的過程中發揮重要的作用[12]。 IL-10可抑制炎癥因子合成和抑制嗜酸性粒細胞、肥大細胞釋放組胺、白三烯等物質，減輕炎癥反應[13]。IgE是AR最重要的監測指標，當患者接觸變應原后，機體輔助性T細胞(Th細胞)活化并產生免疫應答，激活B細胞形成變應原特異性IgE，且IgE又與其受體相互交聯，釋放組胺、緩激肽等炎性介質，促使炎細胞因子和嗜酸性粒細胞異常表達[14-15]。本研究結果顯示，黃芪多糖低、高劑量組療效均優于氯雷他定組。

中醫認為氣虛弱、衛表不固、風寒乘虛而入為AR的基本病機，《證治要訣》說：“清涕者，腦冷肺寒所致。”治療關鍵為補肺固表、宣肺通竅。本研究使用的黃芪多糖為黃芪提取物，黃芪具有補氣升陽、益衛固表、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功，《本草匯言》云：“補肺健脾、實衛斂汗、驅風運毒之藥也”，《雷公炮制藥性解》云：“味甘，性微溫，無毒，入肺、脾二經，內托已潰瘡瘍，生肌收口，外固表虛盜汗，腠理充盈”。現代藥理學表明，黃芪含有多糖、黃酮類、三萜類等多種有效成分，具有調節機體免疫和代謝、保護神經和心腦血管系統的作用[16]。黃芪多糖為黃芪的有效成分之一，同樣具有調節免疫、增強免疫的功效，且已有研究顯示，黃芪多糖可緩解AR大鼠癥狀和病理改變，從而逆轉鼻部黏膜組織的重塑[17]。一項大鼠實驗表明，黃芪甲苷通過抑制高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4/核因子κB通路降低IL-4、IL-6等多種炎癥因子水平[18]。研究表明，黃芪多糖可改善AR豚鼠模型的癥狀、病理改變，其機制可能與調節Th17/Treg水平，以及相關細胞因子牛叉頭型基因P3和維甲酸相關孤核受體γt(RORγt)的表達相關[19-20]。本研究模擬臨床中、西醫治療方案，探究了氯雷他定組、黃芪多糖低和高劑量組對AR模型大鼠的治療作用，結果顯示黃芪多糖能夠有效緩解大鼠癥狀，其機制可能與調節大鼠Th17/Treg平衡、改善炎癥因子表達相關。本研究論證了黃芪多糖對AR大鼠的治療作用以及其對機體免疫和炎癥細胞表達的干預調控，但對其免疫和炎癥上下游分子機制仍不明確，仍需進一步設計相關分子實驗驗證其具體機制，為黃芪多糖治療AR的臨床應用提供理論依據。