固相萃取凈化-離子色譜法測定不同生長期新鮮煙葉中的7種無機(jī)陰離子

劉 欣 岳艷麗 黃海濤 曾婉俐 許 永孔維松 楊葉昆 米其利 李 晶*

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，昆明 650106；2. 云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明 650031)

無機(jī)陰離子廣泛存在于煙草中，對煙草生長過程中的生理代謝具有重要作用，也影響著煙葉的品質(zhì)[1-2]，例如NO2-與NO3-和煙株氮代謝相關(guān)，與生長發(fā)育有直接聯(lián)系，例如Cl-與卷煙的燃燒性有負(fù)面影響；SO42-、PO43-不僅與煙葉生理生長具有重要的影響，還與煙葉品質(zhì)有直接關(guān)聯(lián)[3-5]。對于煙葉中的無機(jī)陰離子的檢測，我國煙草行業(yè)還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，存在不同無機(jī)離子采用不同方法的情況，例如：SO42-的測定主要有硫酸鋇比濁法、重量法和沉淀滴定法等，NO3-、Cl-則采用連續(xù)流動分析法，以上方法均存在無法同時分析多種無機(jī)陰離子，且操作復(fù)雜，靈敏度不理想等缺點(diǎn)[6-8]。

離子色譜(Ion Chromatography，IC)法是利用被測物質(zhì)的離子性進(jìn)行分離和檢測的液相色譜方法[9-11]，目前，離子色譜由于其對于離子態(tài)物質(zhì)分析檢測的獨(dú)特優(yōu)勢，以及操作簡便，靈敏度高，精密度高的特點(diǎn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品[12-13]、環(huán)境[14-16]、醫(yī)藥[17-18]、煙草[19-20]等多個領(lǐng)域，可為煙草中無機(jī)離子的檢測提供分析手段；而離子色譜法由于其分離檢測的特殊性，針對復(fù)雜基質(zhì)都會采用凈化手段來保障檢測的順利進(jìn)行，固相萃取凈化就是其中一種有效的方法[21-22]，目前通過固相萃取凈化，離子色譜分析不同生長期新鮮煙葉中的無機(jī)陰離子的報道還較少。

本研究擬建立離子色譜法測定煙葉中重要無機(jī)陰離子，利用固相萃取的方式進(jìn)行樣品凈化，通過比較分析不同生長時期的煙葉中無機(jī)陰離子的變化，可以為無機(jī)陰離子對煙葉生長發(fā)育的影響提供檢測方法和數(shù)據(jù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7種(F-、Cl-、Br-、NO2-、NO3-、SO42-、PO43-)無機(jī)陰離子色譜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL，購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心)，氫氧化鈉(分析純，購于四川西隴科學(xué)有限公司)，實驗用水均為超純水，甲醇購于美國Merck公司；63個煙葉樣品為云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心(昆明)提供，含苗期樣品21個，現(xiàn)蕾期樣品21個，成熟期樣品21個。

ICS-5000型離子色譜儀(美國DIONEX公司)，AERS 500陰離子抑制器(4 mm)，陰離子色譜柱：AS11-HC(4 mm×250 mm)，含相同規(guī)格陰離子保護(hù)柱；固相萃取小柱RP 1.0cc(希波氏)，SB2200T超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器公司)，Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 實驗條件

1.2.1 溶液配制

7種無機(jī)陰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(10 μg/mL)：準(zhǔn)確移取1 000 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL至10 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，混勻，4 ℃下保存；使用時，移取不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 離子色譜條件

色譜柱：AS11-HC(4 mm×250 mm)，含相同規(guī)格陰離子保護(hù)柱；流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量25 μL，流動相KOH(具體濃度通過自動淋洗液發(fā)生器調(diào)節(jié))，梯度洗脫程序為見表1，檢測時間40 min，抑制器電流65 mA，檢測方式為電導(dǎo)檢測。

表1 離子色譜梯度洗脫程序

1.2.3 樣品前處理

取新鮮煙葉樣品，經(jīng)凍干機(jī)凍干，用粉碎機(jī)加工至粉末后分裝備用。

稱取試樣0.1 g(精確至0.000 1 g)置于100 mL三角錐瓶中，加入25 mL NaOH(0.1 mol/L)，超聲儀中提取40 min，萃取液以5 000 r/min離心5 min，取上層清液，備用。

取活化后的固相萃取小柱(依次通過5 mL甲醇、5 mL水，吹干)，連接上0.22 μm離子色譜專用微孔濾膜，取3～4 mL上清液緩慢過固相萃取柱及微孔濾膜，過濾前1 mL濾液棄去，后續(xù)濾液收集在色譜瓶中，等待上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

AS11-HC是離子交換容量較高的一類離子色譜柱，常用來分離分析不同價態(tài)的無機(jī)陰離子。分別用10、20、30 mmol/L KOH進(jìn)行等度淋洗7種陰離子，發(fā)現(xiàn)10 mmol/L KOH對于高價態(tài)的SO42-、PO43-洗脫能力不夠強(qiáng)，且SO42-、PO43-峰形變寬變矮，不利于分析；20 mmol/L KOH 分離條件下，F(xiàn)-、Cl-、Br-、NO2-、NO3-分離度不理想，對于實際樣品來說不利于定量檢測；30 mmol/L KOH由于洗脫能力較強(qiáng)，但是也導(dǎo)致了一價無機(jī)陰離子的分離不理想。因此本研究考慮采用梯度洗脫的方法來分離不同價態(tài)、不同離子交換能力的無機(jī)陰離子，由于梯度起始洗脫能力較弱，可以將一價無機(jī)陰離子較好地分離，而到了離子交換能力較強(qiáng)的多價態(tài)離子的時候，迅速提高洗脫濃度，有利于SO42-、PO43-離子的有效洗脫與分離，經(jīng)過優(yōu)化，確定的梯度淋洗程序為：0～10 min，10 mmol/L KOH保持不變；10～25 min，10 mmol/L遞增至30 mmol/L KOH；25～30 min，30 mmol/L KOH還原至初始狀態(tài)；30～40 min，保持10 mmol/L KOH以平衡色譜柱。在此分離程序下，7種離子可以較好地得到分離，峰形較為理想，分離度佳。色譜分離圖見圖1。

圖1 無機(jī)陰離子標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜分離圖Figure 1 Chromatographic separation chart of inorganic anions standard samples.

2.2 樣品前處理優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑優(yōu)化

分析煙葉中無機(jī)陰離子時，文獻(xiàn)中提到堿性環(huán)境可以更好地提取出無機(jī)陰離子，而且堿性的溶劑也較為適應(yīng)離子色譜分離系統(tǒng)，本研究分別考察了水、0.05 mol/L NaOH水溶液、0.1 mol/L NaOH水溶液、0.5 mol/L NaOH水溶液、1.0 mol/L NaOH水溶液對同一煙葉樣品的提取效果，以提取無機(jī)陰離子的峰面積為考察對象，圖2發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L NaOH水溶液提取條件下，7種無機(jī)陰離子的峰面積最高，因此選擇0.1 mol/L NaOH水溶液為實驗提取試劑。

圖2 不同提取溶劑濃度對提取效率的影響Figure 2 The effect of different solvent on the extracion efficiency.

2.2.2 提取時間優(yōu)化

一定時間的提取可以有效地將煙葉中的無機(jī)陰離子轉(zhuǎn)移到提取液中，實驗考察了不同時間對提取效果的影響，主要對比了提取時間分別為10、20、40、60 min的提取結(jié)果，以無機(jī)陰離子的峰面積為考察對象，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取時間到40 min的時候，提取結(jié)果趨于最大，提取時間再加大也沒有明顯的升高。為了兼顧提取效率和分析效率，故選擇提取時間為40 min。

2.2.3 固相萃取柱優(yōu)化

煙葉中含有大量的脂類、色素、糖類、氨基酸、蠟質(zhì)以及其他纖維素等成分，對于無機(jī)陰離子分析具有較大的干擾，尤其是脂類、蠟質(zhì)和色素類物質(zhì)，由于其親酯性，可能會造成色譜柱的污染，甚至?xí)?dǎo)致不可逆的堵塞，因此在進(jìn)行煙葉中無機(jī)陰離子分析的時候，一般都不采用直接進(jìn)樣，而是選擇對樣品進(jìn)行前處理凈化。本實驗分別對比了RP1.0cc、C18300 mg、C18500 mg、HLB四種固相萃取小柱對無機(jī)陰離子的凈化效果及回收率，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明利用RP1.0cc的凈化效果最佳，7種無機(jī)陰離子的回收率均大于96.5%，四種固相萃取小柱對七種無機(jī)陰離子的凈化效果呈現(xiàn)RP1.0cc>C18300 mg>HLB>C18500 mg的趨勢，因此，選擇RP1.0cc固相萃取小柱作為煙葉樣品的凈化柱。

圖3 不同固相萃取柱的凈化效果對比Figure 3 Comparison results for cleanup with different SPE columns.

2.3 方法驗證結(jié)果

2.3.1 方法線性關(guān)系、檢出限和定量限

通過標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(0.10、0.50、1.0、2.0、5.0 μg/mL)，采用選定色譜條件對7種無機(jī)陰離子的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以各組分峰面積為縱坐標(biāo)(y)，對應(yīng)各組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)，計算當(dāng)信噪比S/N=3和S/N=10時所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢出限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 7種無機(jī)陰離子的回歸方程、回歸系數(shù)、檢出限和定量限

結(jié)果可知，7種無機(jī)陰離子在0.10～5.0 μg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性(r>0.996)，檢出限在0.01～0.04 μg/mL，定量限在0.04～0.14 μg/mL。

2.3.2 加標(biāo)回收和精密度實驗

對新鮮煙葉樣品中的7種無機(jī)陰離子進(jìn)行測定，并在前處理前添加一定量(高、中、低 3 個濃度水平)相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定無機(jī)陰離子的重現(xiàn)性，結(jié)果見表3。7種無機(jī)陰離子的加標(biāo)回收率為96.3%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7%～4.8%，可見本方法測定煙葉中的7種無機(jī)陰離子的準(zhǔn)確度和精密度滿足分析要求。

表3 七種無機(jī)陰離子的加標(biāo)回收率和精密度

2.4 實際樣品分析

對本單位提供的新鮮煙葉樣品(含苗期樣品、現(xiàn)蕾期樣品、成熟期樣品)按照實驗方法進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4和表4(F-、NO2-、Br-均未檢出，未列在表中)。

圖4 實際樣品無機(jī)陰離子成熟期的色譜分離圖(峰如圖1)Figure 4 Chromatographic separation diagram of inorganic anion maturity period of actual sample (Peaks：the same as Figure 1).

從表4 中可以發(fā)現(xiàn)，Cl-在整個煙葉生長發(fā)育期間變化較大，苗期時含量最高，現(xiàn)蕾期逐漸下降，成熟期最低；NO3-也呈現(xiàn)的是同樣規(guī)律，這主要是因為Cl-和NO3-在煙葉生長過程中與生長發(fā)育影響較大，煙葉生長主要為碳氮代謝，因此在苗期時以生長為主，需要累積大量的營養(yǎng)元素以便于進(jìn)行植株的長大；PO43-呈現(xiàn)的也基本是這個規(guī)律，苗期適合生長時，累積較多的離子，而到了成熟期，煙葉落黃，基本的物質(zhì)基礎(chǔ)穩(wěn)定；而SO42-則呈現(xiàn)出現(xiàn)蕾期普遍較高，而到了成熟期則有稍微下降，這有可能與成熟期煙葉衰老有關(guān)。從無機(jī)陰離子的變化規(guī)律來看，無機(jī)陰離子與煙葉生長發(fā)育關(guān)系密切，可以為煙葉的品質(zhì)與生長提供重要的數(shù)據(jù)支持。

表4 實際新鮮煙葉樣品中無機(jī)陰離子含量分析

3 結(jié)論

建立了固相萃取凈化-離子色譜測定新鮮煙葉中的無機(jī)陰離子的方法，該方法前處理簡單，便于煙葉凈化，檢測靈敏度高，色譜分離度理想，7種無機(jī)陰離子的檢出限在0.01～0.04 μg/mL，定量限在0.04～0.14 μg/mL，各分析目標(biāo)物在0.10～5.0 μg/mL范圍內(nèi)線性較好，7種無機(jī)陰離子的加標(biāo)回收率為96.3%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為2.7%～4.8%，精密度與準(zhǔn)確度可滿足不同生長期煙葉中無機(jī)陰離子測定的要求。本研究表明，固相萃取凈化-離子色譜法可用于新鮮煙葉樣品中多種無機(jī)陰離子的含量檢測與監(jiān)測，可為不同生長期煙葉中無機(jī)陰離子的分析提供可靠分析方法。