動物模型在Eph家族蛋白功能研究中的應用

胡耀華, 趙菊梅, 師長宏

(1. 延安大學醫(yī)學院,延安 716000; 2. 空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心,西安 710032)

受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）參與細胞生長發(fā)育的各個階段，并與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。多種酪氨酸激酶靶點在開展癌癥治療、預測評估耐藥機制等領域發(fā)揮重要作用。促紅細胞生成素誘導肝細胞激酶（erythropoietin-producing hepatocyte kinase，Eph）作為家族成員最多的RTK，同樣具有廣泛的臨床應用價值［1］。該家族與傳統(tǒng)RTK的不同之處在于其同源配體也是一種膜定位分子。因此，Eph 受體和配體通常介導相同或不同類型細胞間的接觸依賴性轉(zhuǎn)導信號，以調(diào)控細胞的形態(tài)、粘附、增殖、血管生成、分化等細胞生物學行為，在腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用［2］。目前，細胞模型和各類動物模型的應用極大促進了Eph 家族相關基礎研究。在具體研究過程中，研究者根據(jù)實驗目的正確選擇實驗模型對探討Eph 家族相關分子的功能及靶向藥物的研發(fā)至關重要。據(jù)此，本文針對在Eph 家族分子功能研究中，如何選擇合適的動物模型以及不同模型的優(yōu)缺點進行歸納總結(jié)，以期為Eph家族的基礎研究提供參考。

1 Eph家族的結(jié)構(gòu)特點及功能

Eph家族包括Eph受體和Ephrin配體，是已知的家族成員最多的RTK。該家族參與調(diào)節(jié)細胞遷移、聚集、靶向等多種生理效應，在神經(jīng)軸突導向、血管生成及腫瘤形成等方面發(fā)揮重要作用［1］。根據(jù)Eph 家族成員同源性、表達、分布和結(jié)構(gòu)等的不同可細分為受體EphA、EphB 及配體EphrinA、EphrinB 兩個亞類［2］。Eph 受體亞家族共有16 個成員，包括EphA（1～10）以及EphB（1～6），其胞外區(qū)由一個N端球狀結(jié)構(gòu)域、一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和兩個纖連蛋白Ⅲ組成。胞內(nèi)包含具有酪氨酸激酶活性的結(jié)構(gòu)域、不育α 基序（sterile alpha motif，SAM）結(jié)構(gòu)域和C端的突觸后致密蛋白結(jié)合區(qū)域（post-synaptic density protein，discs large，zona occludens，PDZ）結(jié)構(gòu)域［2］。Ephrin 配體的結(jié)構(gòu)則有明顯的不同，包含通過糖脂磷脂酰肌醇連接方式結(jié)合到細胞膜上的EphrinA1～5以及含有跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的EphrinB1～3［2］。Eph受體及Ephrin配體最主要的3 個基本特征是：（1）兩者都是膜定位分子；（2）雖有證據(jù)表明兩者存在可溶性形式，但其相互作用依賴細胞之間的直接接觸［3］；（3）兩者都能傳導信號到宿主細胞，產(chǎn)生雙向信號，這種雙向信號包括Eph 受體產(chǎn)生的正向信號以及Ephrin 配體產(chǎn)生的反向信號。同時，受體、配體的定義不是一成不變的，因為受體能充當配體，反之亦然。介于Eph 家族復雜的表達模式，隨著研究的不斷深入和發(fā)展，針對不同的Eph 功能研究相關的動物模型層出不窮。目前廣泛使用的模型包括異種移植瘤模型、腫瘤免疫治療模型、基因修飾小鼠模型等，不同模型在腫瘤侵襲、遷移、血管生成、耐藥等多種惡性生物學行為的研究中發(fā)揮重要作用。

2 異體移植瘤模型在Eph研究中的應用

人源腫瘤細胞系異種移植（cell line derived xenograft，CDX）模型、原代腫瘤細胞模型（patientderived cell models，PDC）模型和人源腫瘤組織來源移植瘤（patient-derived xenograft，PDX）模型均屬于異種移植瘤模型。它們均以免疫缺陷鼠為受體。CDX 模型是將體外培養(yǎng)的腫瘤細胞通過皮下注射、腹腔注射、尾靜脈注射的方式移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)構(gòu)建的腫瘤動物模型；其特點是易于形成腫瘤，構(gòu)建周期短；大多數(shù)基因功能的體內(nèi)驗證、分子機制的探究都以該模型為基礎，但該類模型缺乏原腫瘤的分子特征及異質(zhì)性［4-5］。將來源于患者的細胞或臨床新鮮的手術(shù)標本移植到小鼠體內(nèi)建立的PDC、PDX 模型，含有源自患者的基質(zhì)細胞和免疫細胞［6］，保留了原發(fā)腫瘤組織的病理學特征，可代替患者用于藥物的篩選、新療法的研發(fā)，但其移植成功率低，構(gòu)建周期長。研究者利用上述模型重點探索了Eph 家族分子在腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥形成中的作用。

2.1 基于異種移植瘤模型研究Eph在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用

大量體內(nèi)外實驗證明，Eph 的異常表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關。為了闡明EFNA4（即EphrinA4）在肝癌發(fā)生中的生物學功能及相關分子機制，Lin 等［7］將過表達EFNA4的肝癌細胞注射到裸鼠的肝臟，構(gòu)建CDX模型。結(jié)果表明，EFNA4 過表達促進了肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移。同樣在結(jié)直腸癌中，Dopeso等［8］敲低CDX 模型中的EphB4 后，結(jié)直腸腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力增加。上述Eph 的研究通常是在單個受體或配體上進行，主要用于證實受體或配體單獨表達對腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。值得注意的是，有證據(jù)表明，在前列腺癌中，EphA2 與配體相互作用能夠介導運動接觸抑制，進而抑制腫瘤的侵襲、遷移［9］。然而，當EphA2獨立存在時，它可以轉(zhuǎn)化為促癌蛋白，通過Akt磷酸化促進腫瘤細胞遷移和侵襲［10］。據(jù)此，Astin等［9］歸因于Eph家族復雜的信號傳導系統(tǒng)，Eph受體、配體以依賴或非依賴形式介導雙重作用。然而仍存在一個關鍵問題，這種模式在體內(nèi)是否依然存在，為此需構(gòu)建動物模型，探討Eph-Ephrin 系統(tǒng)對腫瘤功能的影響。

Qazi等［11］用從腦腫瘤患者收集的細胞建立了PDC模型，證實EphA2 和EphA3 受體共同驅(qū)動腦腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高腫瘤細胞的克隆形成和增殖能力。王潔等［12］通過皮下移植建立14 例胃癌PDX 模型，進一步原位移植成功建立3例胃癌PDX模型，最后通過PCRArray 篩選出3 個與胃癌轉(zhuǎn)移顯著相關的基因，其中就包括了EphB2。

2.2 基于異種移植瘤模型研究Eph在血管生成中的作用

血管生成是一個高度復雜的協(xié)調(diào)過程，在正常發(fā)育和多種疾病進展的病理生理學過程中起著關鍵作用。Eph 家族分子同樣在腫瘤血管生成中扮演重要角色，目前研究其功能的動物模型大多聚焦在CDX 模型。例如，在結(jié)直腸癌中，Lv 等［13］通過穩(wěn)定敲低和過表達EphB4 建立CDX 模型，并使用對照細胞系研究了EphB4 在結(jié)直腸癌中的作用，結(jié)果表明結(jié)直腸癌異種移植腫瘤中的微血管密度與EphB4 顯著相關，EphB4作為與增殖和血管生成相關的腫瘤啟動子，可能是潛在的結(jié)直腸癌治療靶點。Sato等［14］為了確定頭頸部鱗狀細胞癌中EphB2 表達是否調(diào)節(jié)血管生成，將敲低或過表達EphB2 的OSC19 細胞注射到裸鼠的舌頭中，與對照組和EphB2-KD組腫瘤相比，EphB2-OE OSC19腫瘤中的血管密度顯著增加，提示高表達的EphB2 促進腫瘤血管生成。在前列腺癌中，Li 等［15］敲低EphA6的表達建立CDX 模型，體內(nèi)血管生成實驗結(jié)果表明，低表達的EphA6 抑制血管生成。Neuber 等［16］給裸鼠皮下注射過表達EphB4 的A-375 細胞，構(gòu)建人黑色素瘤的CDX 模型，體內(nèi)和離體熒光成像結(jié)果表明，Eph抑制腫瘤血管生成。Festuccia 等［17］基于Eph-Ephrin系統(tǒng)的開發(fā)尋找新的抗腫瘤策略，引入一種靶向Eph/Ephrin相互作用的小分子UniPR1331，其在腦膠質(zhì)瘤的裸鼠異種移植和原位癌模型中均抑制血管生成，具有顯著的抗腫瘤活性。

2.3 基于異種移植瘤模型研究Eph 在耐藥中的作用

原發(fā)及繼發(fā)耐藥是腫瘤治療過程中迫待解決的關鍵問題，而研究耐藥相關機制就必須對關鍵分子進行探索。越來越多的化療藥物通過腫瘤細胞實驗、CDX模型、PDX 模型來進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分Eph 家族分子可作為有前景的藥物靶點，且在不同類型的惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。Miao 等［18］通過生物信息學分析、細胞實驗和CDX 模型證實，EPHA2 抑制劑ALWII-41-27 和HG-6-64-1 可有效抑制耐威羅非尼（vemurafenib tablet，VEM）的黑色素瘤細胞增殖；同樣，作者構(gòu)建了人黑色素瘤細胞A-375 的裸鼠CDX 模型并連續(xù)40周使用順鉑治療，發(fā)現(xiàn)EphB4過表達與腫瘤細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性有關。此外，順鉑與EphB4選擇性抑制劑的組合可以削弱這種獲得性耐藥機制［19］。為真實模擬臨床，Leung 等［20］將臨床新鮮的肝癌手術(shù)標本移植到BALB/c裸鼠皮下建立肝癌PDX模型，通過持續(xù)對裸鼠使用索拉菲尼灌胃，構(gòu)建耐索拉菲尼的PDX模型，利用該模型進行RNA測序分析，確定EphB2 是上調(diào)最顯著的激酶；在此基礎上進一步確定EphB2/β-catenin/TCF1 的正反饋通路增強了肝癌的腫瘤細胞干性和索拉非尼耐藥性，揭示其可能是抗肝癌耐藥的有效治療策略。而Toosi 等［21］分別采用相應的乳腺癌CDX和PDX模型對體外細胞學實驗進行體內(nèi)驗證，結(jié)果表明沉默EphB6 促進了腫瘤的生長，增加了乳腺癌對多柔比星的耐藥性。

隨著藥物聯(lián)合治療方案的優(yōu)化及給藥系統(tǒng)的完善，pH敏感性脂質(zhì)復合物、線粒體靶向偶聯(lián)物等新型給藥途徑在提高藥物療效、降低藥物毒性以及特異靶向腫瘤部位等多方面發(fā)揮重要作用。Zhang等［22］設計了一種兼具pH敏感性和主動靶向性的多功能給藥系統(tǒng)，成功獲得具有良好理化性質(zhì)的EphA抗體偶聯(lián)多柔比星的脂質(zhì)復合物。為了驗證其效能，該研究建立了人乳腺癌細胞MCF-7的CDX模型，分組注射不同劑型的脂質(zhì)復合物，結(jié)果表明脂質(zhì)復合體對MCF-7細胞具有良好的細胞毒性作用，并克服了多藥耐藥效應。同樣在人乳腺癌細胞MCF-7 的CDX 模型中，Zhang 等［23］進一步評估了不同制劑的抗腫瘤活性，證實一種新型的線粒體靶向偶聯(lián)物三苯基膦-多西他賽融合脂質(zhì)體（EPSLP/TD）的制劑能夠有效地將抗腫瘤藥物遞送到腫瘤細胞的線粒體，并誘導線粒體介導的細胞凋亡。這些結(jié)果提示，應用動物模型評估新型給藥方式對逆轉(zhuǎn)化療藥物耐藥、提高晚期患者的存活率具有重大意義。

總之，Eph-Ephrin 系統(tǒng)在癌癥轉(zhuǎn)化和進展的每個階段都發(fā)揮作用，它可以成為篩查、預后評估和治療的有效工具，但由于其復雜的表達模式、雙向信號系統(tǒng)的傳導及其他系統(tǒng)的串擾，Eph 的研究錯綜復雜，仍有待進一步深入探討。異種移植模型的建立和應用為探究Eph家族分子創(chuàng)造了良好的條件。

3 腫瘤免疫治療模型在Eph研究中的應用

腫瘤免疫治療模型的應用推進了腫瘤相關免疫、干細胞等方面的研究。不同種類的腫瘤免疫治療模型可移植不同的腫瘤或細胞，特別是重度聯(lián)合免疫缺陷的NSG 小鼠能夠植入正?；虬┳兊娜祟惣毎蚪M織，為人源化研究提供良好的實驗工具。例如，移植人類免疫細胞，包括人外周血單核細胞［24］或造血干細胞［25］，使小鼠擁有部分人類免疫功能，兼具評價免疫治療效果、免疫調(diào)節(jié)劑的作用，在腫瘤免疫創(chuàng)新藥物研發(fā)中有著廣泛的應用前景。此外，有研究人員將PDX腫瘤與患者來源的免疫細胞相結(jié)合［26］，實現(xiàn)了精準的個體化免疫治療研究。

以免疫檢查點（immune checkpoint）抑制劑和嵌合抗原受體T 細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）治療為代表的新型免疫療法開啟了腫瘤免疫治療的新方向。大量研究表明，Eph家族分子在單核細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞等多種免疫細胞中異常表達［27-29］，且在細胞發(fā)育、分化、激活和增殖中發(fā)揮關鍵作用。因此，NOD-SCID、NCG/NSG/NOD 等免疫功能缺陷相關小鼠模型在Eph研究中具有獨特的用途。NOD-SCID 小鼠具有T細胞、B細胞缺陷，先天免疫水平低，模型構(gòu)建周期短，重復性好，適用于多種腫瘤細胞移植，但不適于長期實驗［30］。NCG/NSG/NOD 小鼠在NOD-SCID 基礎上敲除IL-2Rg基因，在缺失T細胞、B細胞的同時缺少NK細胞，免疫缺陷程度更高；此類小鼠建模成功率高，穩(wěn)定性好，經(jīng)過傳代后仍能保持原代腫瘤的異質(zhì)性，可用于長期實驗［31］。第一個被鑒定為腫瘤相關抗原的Eph 分子是EphA2［32］，它在包括黑素瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中過度表達。隨后證實EphA2 受體在人CD4+T 或CD8+T 細胞中有多個識別位點［33-34］，是Eph家族中研究最廣泛的腫瘤相關抗原。

3.1 基于腫瘤免疫治療模型研究Eph在疫苗制劑中的作用

腫瘤相關抗原-樹突細胞（dendritic cells，DCs）因其可誘導腫瘤抗原特異性細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T cell，CTL）和輔助T細胞而成為強有力的抗癌工具［35］。Yamaguchi等［36］以C57BL/6小鼠為研究對象，腹腔注射抗CD4 抗體、抗CD8 抗體、自然殺傷（natural killer，NK）細胞抑制劑抗asialo GM1 抗體，構(gòu)建T細胞和NK細胞雙缺乏的結(jié)直腸癌免疫相關小鼠模型，用于評估接種EphA2 衍生肽（Eph-DCs）疫苗的抗腫瘤免疫治療情況；結(jié)果顯示，EphA2 陽性小鼠的免疫治療效果更好，抑瘤作用更強，提示Eph-DCs疫苗對EphA2 陽性的腫瘤具有特異的殺傷力。此外該團隊進一步證明Eph-DCs 疫苗對肝腫瘤細胞的再次攻擊具有長期的免疫效果［37］。上述證據(jù)表明，基于腫瘤免疫治療模型獲得的腫瘤相關抗原-DCs 疫苗的新策略有望提高晚期癌癥患者的臨床療效。

3.2 基于腫瘤免疫治療模型研究Eph在CAR-T細胞治療中的作用

CAR-T 細胞療法的基本原理是利用患者自身的免疫細胞來清除癌細胞［38］。許多腫瘤相關抗原的CART 細胞已在動物模型上驗證并用于臨床治療。動物模型在CAR-T細胞的有效性和安全性等研究中具有重大意義。

Chow等［39］開發(fā)了EphA2特異的嵌合抗原受體，T細胞能夠在體外識別和殺傷EphA2 陽性的成神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤，并在成神經(jīng)細胞瘤原位異種移植的SCID小鼠模型中誘導腫瘤消亡。此外，在非小細胞肺癌中，EphA2 特異的嵌合抗原受體能識別殺死EphA2 陽性的肺癌細胞［40］，同時在SCID 小鼠肺癌模型中，同樣證明EphA2-CAR-T療法有明顯的抗腫瘤作用。在食管鱗狀細胞癌中，研究者構(gòu)建了EphA2-CAR-T細胞，發(fā)現(xiàn)該CAR-T 細胞具有劑量依賴性的細胞殺傷作用［41］。盡管CAR-T 細胞療法在臨床療效上取得了重大突破，但是CAR-T 細胞的處理方式、靶抗原親和力、T 細胞的數(shù)量和質(zhì)量等均影響CAR-T細胞的抗腫瘤效率，且目前尚缺乏評估CAR-T 抗腫瘤效率的標準［42］。針對此現(xiàn)象，An 等［43］選擇NOD-SCID 小鼠構(gòu)建腦膠質(zhì)瘤異種移植模型，探討影響EphA2-CAR-T細胞抗腫瘤效率的相關因素，發(fā)現(xiàn)較高水平的γ-干擾素（interferonγ，IFN-γ）和趨化因子受體1/2（chemokine receptor 1/2，CXCR1/2）與較差的抗腫瘤活性相關，提示IFN-γ和CXCR1/2組合是評估CAR-T細胞抗腫瘤效率的關鍵因素。EphA2-CAR-T細胞的發(fā)現(xiàn)與構(gòu)建為腫瘤免疫治療開辟了新的途徑。隨著科研成果的積累，相信更多的Eph相關的CAR-T療法將應用于臨床治療。

3.3 基于腫瘤免疫治療模型研究Eph在免疫聯(lián)合治療中的作用

針對程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）設計的免疫檢查點抑制劑成為近年來腫瘤治療領域的重大突破。最近Eph 靶向化學藥物聯(lián)合免疫治療取得了顯著的臨床療效。Kamoun 等［44］選用BALB/c、A/J、C57BL/6 小鼠腹腔注射抗CD8 抗體，構(gòu)建CD8+T 缺陷的乳腺癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)靶向納米脂質(zhì)體紫杉烷制劑（EphA2-ILs-DTXp）與免疫檢查點抑制劑協(xié)同，增加了CD8+T細胞活性，從而抑制腫瘤生長。為進一步了解PD-L1 的調(diào)控機制，Yang 等［45］選用T、B、NK 細胞缺乏的NOD-SCID 小鼠建立乳腺癌模型，證實EphA10 阻斷劑不僅可以通過阻斷PD-L1/PD-1 信號轉(zhuǎn)導來增強CTL 活性，而且可以增強CTL 向腫瘤組織的浸潤，揭示EphA10作為免疫治療新靶點具有極大的潛力。上述內(nèi)容以鼠源的免疫系統(tǒng)為研究基礎，不能模擬人的實際情況。而人源化小鼠模型解決了這一問題，可用于人類生物學研究和臨床治療方案的開發(fā)，同時能更好地探討Eph相關免疫制劑的研發(fā)。Eph家族分子是極具希望的免疫治療的靶點，盡管會面臨一些問題，諸如在不同的環(huán)境下，Eph 信號轉(zhuǎn)導具有雙重作用，受體配體產(chǎn)生的正向、反向信號在同一功能的研究中可能產(chǎn)生相同或完全相反的作用，且Eph 家族成員眾多，同一受體可與多種配體結(jié)合，其表達模式復雜，研究冗雜，但該家族高度保守的進化序列為以Eph 為基礎的免疫療法的開發(fā)和動物模型驗證創(chuàng)造了機會。

4 基因修飾小鼠模型在Eph研究中的應用

基因修飾小鼠（genetically modified mice）同樣為Eph 關鍵分子的功能研究提供了良好工具?；蛐揎椥∈笫峭ㄟ^基因敲除、基因突變等手段對小鼠基因進行改造而建立的腫瘤模型，該模型為潛在癌基因、藥物靶點的驗證、腫瘤免疫治療、目的基因在體研究開創(chuàng)了新策略。但該類小鼠模型構(gòu)建周期長、工作量大、成本高。Fawal等［46］構(gòu)建了人腦類器官（patientderived organoids），尋找抑制腦腫瘤起始細胞自我更新、分化等的可能途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用重組配體EphrinB1-FC 激活EphB 受體會降低二氫葉酸還原酶的表達，影響腦腫瘤起始細胞的自我更新及分化能力。Mateo-Lozano 等［47］通過一系列的體外實驗發(fā)現(xiàn)，EphB6 并不調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞粘附、遷移，但EphB6缺失可以調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、發(fā)展；構(gòu)建EphB6 敲除小鼠模型后證明，EphB6 缺失確實能促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移與擴散。在髓母細胞瘤中，先前的研究表明EphA4、EphA7 受體以及EFNA5 配體介導腫瘤細胞的遷移。在此基礎上構(gòu)建EphA4、EphA7 雙基因敲除小鼠模型，探討EphA4 和EphA7 缺失對髓母細胞瘤的影響及其與p-Akt 水平的相關性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨敲除EphA4、EphA7 或聯(lián)合敲除并不影響髓母細胞瘤的生長，但與Akt 磷酸化水平密切相關［48］。Jackson 實驗室研發(fā)了一種C57BL/6J-Epha4rb-2J/GrsrJ 小鼠突變體，通過限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)獲得該小鼠突變體中基因缺陷的詳細信息，為拓展EphB4 的功能研究奠定了基礎［49］。如上所述，基因敲除是使動物體內(nèi)某種正常的基因失活，觀察該基因不表達會對個體產(chǎn)生哪些影響。而基因突變是確定某一未知基因與疾病的關系。兩種基因編輯動物模型均可以推動特異性Eph 所致疾病的研究，直觀反映其在體內(nèi)的功能。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，利用異種移植模型、腫瘤免疫治療模型和基因修飾小鼠模型，研究者不僅揭示了單個Eph受體或Ephrin 配體調(diào)控腫瘤的相關分子機制，而且以上述三種模型為基礎可以探討多個受體或多個配體相互協(xié)調(diào)的復雜信號通路，驗證多個Eph 共同靶向的生物學功能及靶向治療。但仍存在一些關鍵問題，包括如何提高移植成功率、如何加快建模進程、如何優(yōu)化保存條件、減少微生物感染等?？傊?，選擇合適的動物模型，或?qū)⒍喾N模型聯(lián)合應用，以及類器官等其他模型的佐證，可能會更加準確地闡明Eph 復雜的信號轉(zhuǎn)導通路，揭示疾病發(fā)生發(fā)展的相關機制。

[作者貢獻Author Contribution]

胡耀華采集整理文獻，設計文章框架，并進行文章撰寫；趙菊梅和師長宏修改文章關鍵性問題并審核定稿。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。